重組人肝再生增強(qiáng)因子可逆轉(zhuǎn)免疫損傷性肝纖維化

1、    重組人肝再生增強(qiáng)因子可逆轉(zhuǎn)免疫損傷性肝纖維化        摘要目的：了解重組人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)抗免疫損傷性肝纖維化的活性。方法：建立人血白蛋白免疫損傷性大鼠肝纖維化模型。模型完成后予hALR 腹腔注射。觀察肝纖維化大鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)水平，肝組織膠原蛋白含量及肝臟病理學(xué)改變。結(jié)果：重組人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)可降低肝纖維化大鼠的ALT、AST、LDH水平；肝組織膠原蛋白含量的測(cè)定表明hALR治療

2、組大鼠肝組織膠原含量明顯低于模型組及陰性對(duì)照組；病理組織切片也發(fā)現(xiàn)hALR治療組大鼠肝纖維化程度較模型組及陰性對(duì)照組明顯減輕。結(jié)論：重組人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)可逆轉(zhuǎn)免疫損傷性大鼠肝纖維化。主題詞重組蛋白質(zhì)類； 免疫刺激復(fù)合物； 肝疾病中分類號(hào)R322.4+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)04-0298-03 The reversal effects of recombinant human augmenter of liver regeneration in immunocomplex induced liver fibrosisWANG Ai-min， DU Shu

3、ang-cun， GUO Rui-feng, (252 Hospital of PLA, Baoding 071000, China)YANG Xiao-ming,WANG Qing-ming， HE Fu-chu(Academy of Militory Medical Science, Beijing 100850, China)Abstract AIM: To observe the anti-fibrosis activity of recombinant human augmenter of liver regeneration (hALR). METHODS: Albumin ind

4、uced rat model of liver fibrosis was established and hALR was given peritoneally after the model production. Serum concentration of alanine aminotransferase(ALT),aspartic aminotransferase(AST),lactate dehydrogenase(LDH), hepatic collagen contents and pathological examination were selected as observi

5、ng parameter. RESULTS: Recombinant human augmenter of liver regeneration (hALR) could decrease ALT, AST, LDH concentration of fibrotic rats. The measurements of hepatic collagen contents showed that hepatic collagen contents in hALR treatment group was much lower than those of model group and negati

6、ve control group. Pathological examination also indicated that the degree of liver fibrosis in hALR treatment group was attenuated in comparison with those of model group and negative control group. CONCLUSION: Recombinant human augmenter of liver regeneration (hALR) had reversal effects on immunoco

7、mplex induced rat liver fibrosis.MeSHRecombinant proteins; Immunostimulating complexes; Liver diseases肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration, ALR)是Hagiya等11994年從新生大鼠肝組織中克隆的一種理化性質(zhì)與肝刺激物(hepatic stimulator substance,HSS)相似的促肝細(xì)胞增殖因子。新近，楊曉明等2克隆了大鼠ALR的人類同源分子。并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲高效表達(dá)菌株，進(jìn)而獲得重組hALR3。生物活性研究表明：重組hAL

8、R在體外實(shí)驗(yàn)中可提高CCl4誘導(dǎo)損傷肝細(xì)胞的存活率，降低受損細(xì)胞的LDH釋放率。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明：重組hALR對(duì)急性肝損傷有良好的治療作用4。我國(guó)是肝炎的高發(fā)區(qū)，慢性肝病的治療一直是肝病界研究的熱點(diǎn)。初步研究表明從哺乳動(dòng)物幼仔肝、胚胎肝組織提取的HGF.HSS有抗慢性肝損傷的作用。本研究旨在以人血白蛋白免疫損傷性大鼠肝纖維化為模型，觀察重組人肝再生增強(qiáng)因子(recombinant human augmenter of liver regeneration,hALR）對(duì)已形成的肝纖維化的治療作用。材料和方法一、 材料(一)動(dòng)物Wistar大鼠120只，雌雄各半，體重180220 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院

9、動(dòng)物中心提供。(二)人ALR自行構(gòu)建的pBV-hALR表達(dá)菌株3 ，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化，獲純度95%的hALR。(三)其它實(shí)驗(yàn)材料人血白蛋白為衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所產(chǎn)品。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品為中國(guó)科學(xué)院中生公司產(chǎn)品。二、方法(一)模型的復(fù)制、動(dòng)物分組及標(biāo)本留取模型復(fù)制參照王寶恩等5的方法復(fù)制人血白蛋白免疫損傷性肝纖維化模型。用100只Wistar大鼠造模，完成后存活64只。動(dòng)物分組：正常組20只；模型組20只；hALR治療組22只：造模完成后腹腔注射hALR 50 g/kg，每日1次，共治療2個(gè)月。陰性對(duì)照組22只：造模完成后每日腹腔注射等量生理鹽水，時(shí)間同hALR治療組。標(biāo)本留?。焊鹘M動(dòng)物在hAL

10、R治療前(即造模后)、hALR治療1月、hALR治療2月時(shí)每次分別活殺6只。切取肝臟同一部位,除留病理檢查外，余迅速投入液氮,此后轉(zhuǎn)入70保存待檢，血液樣品離心后取血清送檢。(二)肝組織膠原蛋白含量測(cè)定參照鄭少雄等6的方法，略有改動(dòng)，將所得結(jié)果羥脯氨酸含量換算為膠原蛋白含量。(三)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartic aminotransferase, AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的測(cè)定：用意大利Biotechcnica instruments生產(chǎn)的BT3000TARG

11、A全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。(四)統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)以±s表示；各組、各觀察點(diǎn)間行單因素方差分析處理。結(jié)果一、hALR對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT、AST、LDH水平的影響(見表1)表1hALR對(duì)血清ALT、AST、LDH水平的影響Tab1Effects of hALR on the serum concentration of ALT, AST and LDH(U/L，±s,n=6)Pretreatment Treat 1 monthTreat 2 monthsALT42.3±5.745.3±3.639.9±5.1NormalAST138.7±1

12、6.4143.7±20.2146.5±11.8LDH896.3±101.3906.2±97.7920.3±136.9ALT82.3±10.663.5±7.838.6±4.3ModelAST320.1±29.6236.1±20.2143.1±12.0LDH1796.3±203.31386.3±107.2896.3±103.1Negative controlALT79.5±9.865.3±5.946.6±7.9AST298.7&#

13、177;30.1229.6±19.71136.1±15.8LDH1834.1±195.51307.5±99.1908.8±79.5ALT83.4±12.347.3±5.1*43.6±3.6hALRAST307.5±20.6139.6±12.8*140.3±11.5LDH1867.5±204.3967.1±81.1*936.1±77.8*P0.01,vs model and negative control group 由表1可見,治療前模型組、陰性對(duì)照組、

14、hALR組血清ALT、AST、LDH水平無顯著差異，明顯高于正常組。治療1個(gè)月時(shí)，模型組及陰性對(duì)照組血清ALT、AST、LDH水平較治療前有所下降，而hALR治療組血清ALT、AST、LDH水平下降更低，與模型組及陰性對(duì)照組相比有顯著差異(P值均0.01)。治療2個(gè)月時(shí)，各組血清ALT、AST、LDH均已降至與正常對(duì)照組水平間無顯著差異。二、hALR對(duì)肝纖維化大鼠肝組織原蛋白含量的影響(見表2)表2hALR對(duì)各組大鼠肝組織膠原蛋白含量的影響Tab 2 Effects of hALR on hepatic collagen content (mg/g，±s)PretreatmentTr

15、eat 1 monthTreat 2 monthsNormal1.93±0.121.97±0.141.97±0.12Model6.45±0.175.93±0.125.35±0.17Negative control6.52±0.275.88±0.225.39±0.17hALR6.45±0.164.87±0.13*3.86±0.22*P0.01,vs model and negative control 由表2可見，治療前模型組、陰性對(duì)照組、hALR組肝組織膠原蛋白含量無明顯差異

16、，均數(shù)倍于正常對(duì)照組。治療1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)，模型組、陰性對(duì)照組肝組織膠原蛋白含量較治療前逐漸下降，而hALR治療組肝組織膠原蛋白含量下降更為明顯，與模型組及陰性對(duì)照組相比有顯著差異(P均0.01)。三、重組人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理變化的影響肝組織切片HE染色光鏡下可見：治療前模型組 、陰性對(duì)照組、hALR治療組3組大鼠肝細(xì)胞廣泛壞死，脂肪變性，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生明顯，將肝小葉分隔包繞成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)。治療1月、2月時(shí)hALR治療組上述病理改變明顯減輕，匯管區(qū)及小葉間纖維組織增生明顯輕于治療前；治療2月時(shí)僅可見匯管區(qū)纖維組織向小葉間伸展，

17、未完全包裹肝小葉。模型組及陰性對(duì)照組在相對(duì)應(yīng)的觀察點(diǎn)雖也可見病理變化的減輕，但與hALR治療組相比，上述病理改變?nèi)陨趺黠@。討論人血白蛋白免疫損傷性大鼠肝纖維化的形成機(jī)制為抗原-抗體復(fù)合物在肝臟血管壁沉積，激活補(bǔ)體，引起中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)。釋放溶酶體酶、腫瘤壞死因子、IL-1、PDGF等細(xì)胞因子，引起細(xì)胞損傷；損傷局部的微環(huán)境、單核-巨噬細(xì)胞激活后釋放的細(xì)胞因子，均可成為肝臟星狀細(xì)胞的激活劑。現(xiàn)知肝臟星狀細(xì)胞是肝纖維化形成過程中最重要的細(xì)胞，它的活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素。臨床上由慢性肝炎發(fā)展所形成的肝纖維化在發(fā)生機(jī)理上與大鼠免疫損傷性肝纖維化甚為相似。我們既往的研究表明

18、：重組人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)可阻止四氯化碳中毒性大鼠肝纖維化的形成7。本文研究了hALR對(duì)已形成的免疫損傷性肝纖維化的治療作用，結(jié)果表明：hALR可明顯降低肝纖維化大鼠的血清ALT、AST、LDH水平；可明顯降低肝纖維化大鼠的肝組織膠原蛋白含量；病理切片觀察發(fā)現(xiàn)hALR治療組大鼠匯管區(qū)及小葉間的纖維組織沉積較模型組及陰性對(duì)照組顯著為輕。上述結(jié)果表明重組人肝再生增強(qiáng)因子對(duì)免疫損傷性肝纖維化有明顯的逆轉(zhuǎn)作用。重組人肝再生增強(qiáng)因子逆轉(zhuǎn)免疫損傷性肝纖維化的機(jī)理目前尚不清楚。是抑制了膠原蛋白的合成？還是促進(jìn)了膠原蛋白的降解？或兼而有之？對(duì)此我們正在進(jìn)行研究。基于其逆轉(zhuǎn)肝纖維化的活性，hALR可望成

19、為臨床上慢性肝病的治療藥物?；痦?xiàng)目 國(guó)家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(863-102-08-05-1)；全軍醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研基金資助王愛民（解放軍252醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000）杜雙存（解放軍252醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000）楊曉明（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）郭瑞峰（解放軍252醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000）王清明（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）賀福初（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850）參考文獻(xiàn)1Hagiya M ,Francavilla A , Polimence L , et al. Clonin