多形核粒細(xì)胞體外介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制

1、    多形核粒細(xì)胞體外介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制        【摘要】目的探討多形核粒細(xì)胞(PMN)過度激活對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。 方法用PMA將PMN過度激活后，與內(nèi)皮細(xì)胞(EC)共同培養(yǎng)，觀察PMN對EC的直接損傷作用。 結(jié)果過度激活的PMN與EC共同培養(yǎng)時(shí)，EC的形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化，代表EC損傷的指標(biāo)6-keto-PGFl、LDH明顯升高，預(yù)先加入l-P、SOD+CAT均能不同程度地降低6-keto-PGFl、LDH的水平。 結(jié)論P(yáng)MN的過度激活在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起重要作

2、用。【關(guān)鍵詞】多形核粒細(xì)胞-彈性蛋白酶磷脂酶A2氧自由基血管內(nèi)皮細(xì)胞 Mechanism of PMN-mediated injury to endothelial cells in vitroYao Gaiqi*, Wu Xianzhong. *Department of Surgery, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100020【Abstract】ObjectiveTo investigate the injury effects of PMN ag

3、ainst endothelial cells(EC). MethodThe direct injury effects of PMN against EC by incubating the excessively activated PMN with the umbilical EC were observed. ResultIt was found that PMA activated by PMN could release large amount of PMN-E, OFR and PLA2. When excessively activated PMN was incubated

4、 with EC, the morphology of EC changed appreciably and such indexes as 6-keto-PGF1 and LDH could be lowered to some extend by adding 1-P or SOD+CAT in advanced. Conclusionthe excessive activation of PMN plays an important role in the injury of EC.【Key words】Polymorphonucleargranulocyte-elastaseEndot

5、helial cell內(nèi)皮細(xì)胞(EC)遍布體內(nèi)各組織器官，EC的損傷是MODS發(fā)病的共同因素之一。我們在體外將過度激活的多形核粒細(xì)胞(PMN)與EC共同培養(yǎng)，觀察PMN對EC的直接損傷作用。材料與方法1. 材料(1) 1-蛋白酶抑制劑(1-P)；(2) 超氧化物歧化酶(SOD)，3600U/mg；(3) 過氧化氫酶(CAT)；(4) 佛波豆寇醋酸鹽(PMA)；(5) 胰蛋白酶：以上均為SIGMA公司產(chǎn)品。(6) RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液；(7) Hanks液；(8) 粒細(xì)胞分離液(比重1.113)；(9) 淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077)，為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所提供；(10) CO2孵

6、箱；倒置顯微鏡。2. 方法(1) PMN的分離與培養(yǎng)： 取健康志愿者新鮮血，枸櫞酸鈉抗凝，加粒細(xì)胞分離液3ml，分次離心提取PMN后，加含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。(2) EC的分離與培養(yǎng)： 采用安靜1等介紹的胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(1) PMN的激活： 分離得到的PMN培養(yǎng)15分鐘后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109/L，放入24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘，加PMA(終濃度為100g/L)。分組如下：(1)PMN，(2)PMN+PMA。培養(yǎng)4、20、24小時(shí)以后，收集上清液，-70凍存，分別檢測PMN-E含量及PLA2的活性。每一組復(fù)制三份。(2) PMN對EC

7、的損傷及不同藥物對EC損傷的影響： 將預(yù)先培養(yǎng)15分鐘的PMN以PMNEC的比例為101加入每一孔，同時(shí)分別加入1-P，SOD+CAT，培養(yǎng)15分鐘后，加入PMA(終濃度為100g/L)，置37、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)4、20、24小時(shí)，收取上清液，-70凍存，每一組復(fù)制三份。 EC+PMN， EC+PMN+PMA(100g/L)， EC+PMN+PMA+a1-P(1g/L)， EC+PMA+PMA+SOD(200U/ml)+CAT(200U/ml)。4. 檢測指標(biāo)(1)6-keto-PGF1： 藥盒購于東亞免疫技術(shù)研究所。(2) 乳酸脫氫酶(LDH)。(3) 多形核粒細(xì)胞-彈性蛋白酶(PMN

8、-Elastase PMN-E)： 試劑盒購于德國E Merck公司。(4) 磷脂酶A2(PLA2)活性測定，采用陳思峰建立的微量酸滴定法測定PLA2活性。(5) 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 方差分析，q檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)。結(jié)果1. PMN在PMA過度激活下釋放PMN-E，PLA2，PMN-E和PLA2活性在培養(yǎng)上清液中的水平隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而升高。PMN經(jīng)PMA過度激活后，在培養(yǎng)后24小時(shí)上清液中PMN-E，PLA2水平明顯高于未經(jīng)PMA激活的水平。2. 內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變加入活化PMN培養(yǎng)24小時(shí)后，多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞自培養(yǎng)孔脫落，殘留細(xì)胞也失去原有形態(tài)，變?yōu)殚L梭形，胞漿嗜酸性增強(qiáng)，核固縮，染色加深，可見大小不等的

9、空泡，預(yù)先加入1-P或SOD+CAT可以明顯減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷。3. 不同藥物對PMN損傷EC的影響當(dāng)加入PMN-E主要抑制劑1-P或氧自由基清除劑SOD+CAT時(shí)，均能不同程度地降低6-keto-PGF1、LDH的水平，減輕PMN對EC的損傷，如1和2所示。1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中6-keto-PGF1水平    2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMN損傷EC的程度取決于PMN的數(shù)量、刺激的時(shí)間及刺激的強(qiáng)度。低量的PMN幾乎不造成EC的損傷，這說明PMN的毒性產(chǎn)物需要達(dá)到一定的閾值才能產(chǎn)生對EC的損傷。1. PMN-E對EC的損傷作用本實(shí)驗(yàn)說明

10、，PMN釋放的PMN-E是造成EC損傷的重要物質(zhì)。國外的一些實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。在ARDS病人早期，從支氣管肺泡灌洗中可以發(fā)現(xiàn)PMN聚集；而在動物肺損傷時(shí)，通過去除PMN可以減輕肺損害；將激活的PMN與肝細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)代表肝細(xì)胞損傷的酶明顯升高；預(yù)先加入1-P后，可以減輕肝細(xì)胞的損傷，所有這些提示PMN-E在MODS中起著重要作用2。PMN釋放的PMN-E不僅能分解細(xì)胞外基質(zhì)(包括彈性蛋白、膠原、糖蛋白等多種物質(zhì))，而且能夠降解各種在生命活動中起關(guān)鍵作用的血漿蛋白，如免疫蛋白、補(bǔ)體蛋白、凝血因子等，甚至可以損害完整的細(xì)胞3。2. 氧自由基(OFR)對EC的損傷作用本研究結(jié)果表明，加入足夠量

11、的SOD+CAT能明顯地減輕EC的損傷，提示OFR能夠直接損傷EC?？傊?，PMN的激活在細(xì)胞損傷中起重要作用。正常情況下，PMN是宿主的主要防御機(jī)制，但當(dāng)被過度激活時(shí)，則以同樣的機(jī)制引起正常細(xì)胞的損傷。首先，在大量的炎性介質(zhì)刺激下，PMN遷移到炎癥病灶，破壞正常宿主的防御機(jī)制，當(dāng)炎癥刺激重、時(shí)間長時(shí)，PMN遷移到遠(yuǎn)隔器官，造成廣泛的正常宿主細(xì)胞損傷。作者單位： 100020北京紅十字朝陽醫(yī)院外科(么改琦)；天津醫(yī)科大學(xué)(吳咸中)參考文獻(xiàn)1安靜，黎鰲，楊宗城. 胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng). 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990,3:222-224.2Bach-Dansmo ET, Halvorson S, Godal HC, et al. Degradation of fibrin on plasminogen activation. Thrombosis Research, 1994,75:307-317.3N