乳腺癌雌激素受體α基因啟動子甲基化與其蛋白表達的關系

1、乳腺癌雌激素受體基因啟動子甲基化與其蛋白表達的關系 11-04-03 11:05:00 編輯：studa20 作者：布立敬，蘇世振，李紅智，林蓓蓓，張英俊【摘要】 目的：檢測乳腺癌雌激素受體(estrogen receptor， ER)基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，探討乳腺癌ER啟動子甲基化與其蛋白表達及臨床病理的關系。方法 ：采用免疫組化EnVisionTM二步法檢測20例正常乳腺組織、44例乳腺癌組織ER基因的表達，同時運用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)及測序法分別檢測ER基因啟動子A區(qū)和B區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)。結果：32例ER陽性乳腺癌

2、組織中，ER啟動子A區(qū)、B區(qū)甲基化率分別為28.2%和18.8%。12例ER陰性乳腺癌組織中，ER啟動子A區(qū)、B區(qū)甲基化率分別為66.7%和58.3%。ER陽性乳腺癌組、ER陰性乳腺癌組、乳腺癌組的ER啟動子A、B區(qū)甲基化率均較正常組顯著增高(P 0.05)；ER陰性乳腺癌組的ER啟動子A、B區(qū)甲基化率較ER陽性乳腺癌組均顯著增高(P 0.05)。乳腺癌組織ER表達與啟動子區(qū)甲基化之間呈顯著負相關。結論：乳腺癌組織ER基因表達沉默與其啟動子A區(qū)、B區(qū)CpG島甲基化相關，后者有可能成為乳腺癌預后不良的分子檢測指標。 【關鍵詞】 乳腺腫瘤；雌激素受體；DNA甲基化；CpG島；甲基化特異性PCR A

3、bstract: Objective: To detect the methylation of CpG island in estrogen receptor alpha (ER) gene promotor in breast cancer， and study the relationship among ER gene promotor methylation，ER expression，and the clinicopathological characteristics in breast cancer. Methods: The EnVisionTM two-step immun

4、ohistochemistry method was used to detect ER gene expression in 20 cases of normal breast tissues and 44 cases of breast cancer tissues. The methylation of CpG island in ER gene promotor region A and B was respectively detected using methylation-specific PCR (MSP) and sequencing. Results: In 32 case

5、s of ER positive breast cancer tissues， the methylation rates of ER promotor region A and B were 28.2% and 18.8%，respectively; while in 12 cases of ER negative breast cancer tissues， the methylation rates of ER promotor region A and B were 66.7% and 58.3%，respectively. The methylation rates of ER pr

6、omotor region A and B in ER negative breast cancer tissues， ER positive breast cancer tissues and breast cancer tissues were significantly higher than that in normal breast tissues (P 0.05). The methylation rates of ER negative breast cancer tissues were significantly higher than that of ER positive

7、 cases (P 0.05). A negative relationship was indicated between ER expression and the promotor methylation in breast cancer. Conclusion: The silencing of ER gene expression is suggested to be significantly related with the methylation of CpG island in the ER promotor region in breast cancer. The meth

8、ylation of CpG island may become the molecular marker indicating bad prognosis of breast cancer. Key words: breast tumor；estrogen receptor；DNA methylation；CpG island；MSP 雌激素活體（estroqen receptor，ER）是抗雌激素類藥物內分泌治療的靶點，也是預后的重要指標1-4。ER陰性或表達下調是內分泌治療失敗及預后不良的因素。約1/4乳腺癌組織無ER表達，并且原先ER陽性的乳腺癌患者在腫瘤進程中有1/3轉為ER陰性5。

9、有文獻報道，ER陰性與基因的變異（如插入、缺失、重組或點突變等）未發(fā)現(xiàn)有明確的聯(lián)系，而DNA甲基化是其表達失活的主要原因之一6。研究顯示，啟動子異常甲基化在許多腫瘤的發(fā)生過程中是一個頻發(fā)的早期事件，因此腫瘤相關基因的甲基化狀態(tài)是腫瘤發(fā)生的一個早期敏感指標，可以作為一種有前景的腫瘤分子標志物。本研究運用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)分別檢測正常乳腺組織、乳腺癌組織ER基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)，分析乳腺癌ER啟動子甲基化與其蛋白表達及臨床病理的關系，進一步探討ER啟動子甲基化作為乳腺癌臨床診斷和治療的分子標志物的可能性，為腫瘤去甲基化治療提供

10、理論依據(jù)。 1 材料和方法 1.1 標本來源 由溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院病理科提供新鮮組織標本。包括20例正常乳腺組織和44例乳腺癌組織。病理組織學分型(WHO標準)：浸潤性癌33例，浸潤性小葉癌伴浸潤性導管癌1例，黏液腺癌3例，導管內癌5例，髓樣癌2例?；颊呔鶠榕?。年齡2778歲，平均(48.78.9)歲。 1.2 免疫組化EnVisionTM二步法 抗ER抗體和通用型二步法檢測試劑盒均為北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品。染色操作按照試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗為空白對照。以試劑盒中提供的已知陽性片為陽性對照。ER陽性物質(棕黃色)位于胞核。每張切片隨機選擇10個高倍視野，每個視野隨機

11、觀察100個細胞，計算其中陽性細胞比例(陽性細胞按染色棕褐、棕黃、淺黃分別乘以系數(shù)1、2/3、1/3來計算數(shù)目)。ER陽性細胞比例10%計作陽性。 1.3 DNA提取 新鮮組織標本，經(jīng)蛋白酶K消化，酚、氯仿、異戊醇法提取DNA，并測定DNA濃度和含量。 1.4 DNA亞硫酸氫鹽修飾 加熱變性，NaHSO3修飾，透析除鹽，沉淀，溶解等操作方法參見文獻7。DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后，CpG島中的非甲基化胞嘧啶(C)轉變?yōu)槟蜞奏?U)，經(jīng)PCR 擴增后轉變?yōu)樾叵汆奏?T)；而CpG島中的甲基化胞嘧啶(mC)仍保留為胞嘧啶。CpG島以外序列中的胞嘧啶(C)均轉變?yōu)槟蜞奏?U)，經(jīng)PCR擴增后均為胸腺嘧啶

12、(T)。 1.5 PCR擴增ER基因 1.6 PCR產(chǎn)物直接測序 提供啟動子A、B區(qū)非甲基化引物和甲基化引物的PCR產(chǎn)物，由大連寶生物技術有限公司純化和直接測序。 1.7 統(tǒng)計學處理方法 率的比較采用x2檢驗，根據(jù)x2值計算Pearson列聯(lián)系數(shù)。 2 結果 2.1 ER蛋白表達情況 正常乳腺組織ER陽性表達率為100.0%(20例/20例)。乳腺癌ER表達的免疫組化結果見圖1，ER陽性表達率為72.7%(32例/44例)。乳腺癌較正常乳腺組織的ER蛋白表達顯著降低(P 0.05)（見表1）。 2.2 ER基因啟動子區(qū)甲基化情況 野生型引物(W)、非甲基化引物(U)和甲基化引物(M)的PCR擴

13、增結果見圖2。未修飾DNA的野生型引物(W)的PCR擴增結果，20例正常乳腺組織和44例乳腺癌組織均有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。正常組織、乳腺癌組織ER啟動子A、B區(qū)甲基化率(%)見表1。 隨機各挑選一個修飾后DNA的A區(qū)和B區(qū)甲基化引物擴增產(chǎn)物，進行正向和反向直接測序。正向測序結果的后段和反向測序結果的后段（實際前段）除個別位點外均和預期序列一致，如A區(qū)甲基化引物擴增產(chǎn)物正向測序結果49、63位與預期序列不一致，但這兩個位點的反向測序結果與預期序列一致。綜合正反雙向測序結果與預期甲基化序列完全一致。正向測序結果中，CpG島處所有胞嘧啶C保留不變，CpG島以外的所有胞嘧啶C均已轉變?yōu)樾叵汆奏。反向測序結果中，CpG島處對應的鳥嘌呤G保留不變，CpG島以外的所有鳥嘌呤G均已轉變?yōu)橄汆堰蔄。 2.3 乳腺癌ER基因啟動子A、B區(qū)甲基化與ER蛋白表達的關系 ER陽性乳腺癌組、ER陰性乳腺癌組、乳腺癌組的ER啟動子A、B區(qū)甲基化率均較正常組的顯著增加(P 0.01，見表1)；ER陰性乳腺癌組的ER啟動子A、B區(qū)甲基化率較ER陽性