嗎啡依賴大鼠脊髓Ⅱ板層初級(jí)傳入纖維突觸性終末數(shù)量變化的電鏡定量研究

1、    嗎啡依賴大鼠脊髓板層初級(jí)傳入纖維突觸性 終末數(shù)量變化的電鏡定量研究        【摘要】目的應(yīng)用電鏡定量方法探討在嗎啡依賴條件下，大鼠背根節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)出的初級(jí)傳入纖維能否在脊髓板層側(cè)支出芽和建立新的突觸。方法用光鏡體視學(xué)方法測(cè)知嗎啡依賴組和對(duì)照組大鼠L4脊髓板層橫切面積沒(méi)有差異的情況下，直接比較了兩組動(dòng)物脊髓板層神經(jīng)氈單位面積內(nèi)突觸性終末的數(shù)量變化。結(jié)果嗎啡依賴組脊髓板層來(lái)自初級(jí)傳入纖維的突觸性終末數(shù)，明顯多于對(duì)照組的初級(jí)傳入纖維突觸性終末數(shù)。其中來(lái)自無(wú)

2、髓傳入纖維的突觸性終末數(shù)與對(duì)照組同類型的突觸性終末數(shù)比較增加61%。來(lái)自有髓傳入纖維的突觸性終末數(shù)比對(duì)照組增多70%。尤其是來(lái)自含有致密核芯小泡的初級(jí)傳入纖維突觸性終末數(shù)比對(duì)照組多98%。結(jié)論嗎啡可能促進(jìn)初級(jí)傳入纖維在脊髓板層側(cè)支出芽和建立新的突觸。【關(guān)鍵詞】嗎啡；依賴；脊髓板層；初級(jí)傳入纖維；突觸發(fā)生；側(cè)支出芽【中分類號(hào)】Q189【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】0529-1356(2000)04-302 CHANGES OF SYNAPTIC TERMINAL NUMBER OF PRIMARYAFFERENT FIBERS IN SPINAL CORD LAMINA OFMORPHINE DE

3、PENDENT RAT-AN EM QUANTITATIVE STUDYZENG Yuan-shanCHEN Sui-jun（Division of Neurosciencens,Department of Histology and Embryology）WU Jin-lang（Electron Microscope Room）ZHANG Hui-jun（Departmeat of Anatomy,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,China）【Abstract】Objective Whether the

4、primary afferent fibers given rise by sensory neuron in dorsal root ganglion of rat could make collateral sprouting and form new synapses in spinal lamina under the morphine dependence was explored with EM quantitative method. Methods The number of synaptic terminals in the unit area of neuropil of

5、L4 spinal lamina was compared between morphine dependent and control rats,because there was no significant change in the crosscut area of L-4 spinal lamina of two groups of animal,which was estimated by aid of LM stereological method. Results The number of synaptic terminals from primary afferent fi

6、bers in spinal lamina in morphine dependent group was significantly more than that in control group,among which the number of synaptic terminals from unmyelinated afferent fibers increased 61%.The number of synaptic terminals from myelinated afferent fibers was 70% more than that in control group.In

7、 particular,the number of synaptic terminals containing dense-core vescles from the primary afferent fibers went up 98% over that of control group. Conclusion Morphine may promote the collateral sprouting and synaptogenesis of primary afferent fibers in spinal lamina .【Key words】 Morphine; Dependenc

8、e;Spinal cord lamina; Primary afferent fibers; Synaptogenesis; SproutingHendry等1發(fā)現(xiàn)，嗎啡依賴大鼠的脊髓組織提取液能促進(jìn)體外培養(yǎng)的背根節(jié)神經(jīng)元存活與生長(zhǎng)，并推測(cè)該脊髓產(chǎn)生了某種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)脝岱纫蕾嚧笫笾谱鱾溆酶Ｐ?即切除動(dòng)物一側(cè)腰段背根和背根節(jié)，僅保留L4背根作為備用根)，目的是觀察經(jīng)過(guò)嗎啡作用的大鼠脊髓產(chǎn)生的微環(huán)境變化，對(duì)備用根初級(jí)傳入纖維側(cè)支出芽和突觸重建的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，手術(shù)側(cè)備用根初級(jí)傳入纖維在脊髓后角板層內(nèi)的側(cè)支出芽和突觸重建明顯加快，起到代償因切除大部分背根造成靶神經(jīng)元在結(jié)構(gòu)

9、上和功能上去神經(jīng)支配的作用2。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種慢性注射嗎啡的動(dòng)物，沒(méi)有切除背根側(cè)(非手術(shù)側(cè))的L4背根初級(jí)傳入纖維也發(fā)生了側(cè)支出芽3，4。但還不清楚單純嗎啡依賴大鼠(不做備用根模型手術(shù))的背根初級(jí)傳入纖維，是否也像上述嗎啡作用的備用根大鼠非手術(shù)側(cè)背根初級(jí)傳入纖維那樣，以側(cè)支出芽的方式進(jìn)一步支配靶區(qū)。為此，本研究應(yīng)用電鏡定量方法，探討在嗎啡依賴條件下，大鼠的初級(jí)傳入纖維能否在脊髓后角內(nèi)側(cè)支出芽和建立新的突觸。這對(duì)了解造成嗎啡依賴的形態(tài)學(xué)機(jī)制有重要的理論和實(shí)際意義。材料和方法1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10只SD雄性大鼠，體重約200g，分嗎啡依賴組和對(duì)照組各5只。飼養(yǎng)在正常光、暗周期和籠養(yǎng)環(huán)境。2. 嗎啡依賴動(dòng)物

10、的制備在嗎啡依賴組大鼠腹腔內(nèi)注射1%鹽酸嗎啡(青海制藥廠產(chǎn)品)，每天2次。嗎啡用量是1：第1d 10mg/kg、第2d 20mg/kg,第3d 40mg/kg,第4d 60mg/kg,第5d 80mg/kg、第6d 100mg/kg，以后嗎啡用量維持在每天100mg/kg。對(duì)照組大鼠僅在腹腔內(nèi)注射生理鹽水，每天2次。兩組動(dòng)物于第40d行灌注固定。3. 取材和光鏡及電鏡標(biāo)本的制備用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠。將胸腔打開，經(jīng)左心室主動(dòng)脈插管，先快速灌注每100ml含1%亞硝酸鈉0.2ml和肝素200U的生理鹽水，接著用含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸緩

11、沖液(pH7.4)灌注固定。取出連同背根的腰骶段脊髓，切取一側(cè)L4脊髓后角，置入上述新鮮固定液，4過(guò)液。再入1%鋨酸后固定2h，樹脂包埋。用鉆石刀切取包含整個(gè)板層的橫切超薄切片，裱于400目銅網(wǎng)上，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。并于緊鄰超薄切片處切取半薄切片，裱于載玻片上，甲苯胺藍(lán)染色。4. 測(cè)量、攝片和計(jì)數(shù)半薄切片上辨認(rèn)脊髓后角板層橫切面的要點(diǎn)是：板層呈均勻一致的淺染區(qū)，內(nèi)側(cè)份有背腹走行的有髓纖維束(1)。應(yīng)用體視學(xué)點(diǎn)計(jì)數(shù)法，在光鏡下測(cè)量半薄切片上板層橫切面積。在H600透鏡電鏡(×300)下，按位置關(guān)系將板層所占的銅網(wǎng)孔勾劃于相應(yīng)的方格紙上。再于×8 000下,在板層每個(gè)銅

12、網(wǎng)孔的上、下處各拍攝1張神經(jīng)氈的照片。每例動(dòng)物一側(cè)板層的超薄切片上平均拍攝19張照片。在電鏡照片上辨認(rèn)和計(jì)數(shù)兩類突觸性終末，即主要來(lái)自背根初級(jí)傳入纖維的復(fù)合終末(CT)和主要為非背根神經(jīng)纖維來(lái)源的簡(jiǎn)單終末(ST)58。為區(qū)分兩類終末，僅計(jì)數(shù)有明確突觸性連接，并有35個(gè)以上突觸小泡靠近突觸前膜的終末8；與1個(gè)以上的突觸后成分形成突觸者計(jì)為CT，僅與1個(gè)突觸后成分形成突觸者計(jì)為ST8。以上各項(xiàng)數(shù)據(jù)均經(jīng)兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，求出P值。結(jié)果1. 嗎啡依賴大鼠的行為變化嗎啡依賴組大鼠在注射嗎啡第7d后，開始對(duì)鉗夾其皮膚的刺激表現(xiàn)出異常躁動(dòng)，并隨著注射嗎啡的次數(shù)增加而變得更加明顯。在同籠的大鼠之間受到刺激時(shí)，

13、較容易出現(xiàn)打斗現(xiàn)象(2)。然而對(duì)照組大鼠的行為較為溫馴，即使在注射生理鹽水期間，也不會(huì)因受刺激而發(fā)生攻擊行為。2. L4脊髓后角板層橫切面積表1顯示，嗎啡依賴組大鼠L4脊髓后角板層的橫切面積與對(duì)照組大鼠的比較，沒(méi)有顯著性差異。因此，直接比較兩組大鼠L4脊髓后角板層恒定單位面積(相當(dāng)于108m2)神經(jīng)氈內(nèi)突觸性終末的數(shù)量變化，應(yīng)能反映整個(gè)板層神經(jīng)氈內(nèi)突觸性終末的數(shù)目變化，這為本研究抽樣定量的可比性提供了依據(jù)。3. 板層神經(jīng)氈突觸性終末兩組動(dòng)物L(fēng)4脊髓后角板層神經(jīng)氈內(nèi)，常見(jiàn)各種形態(tài)的ST(3)和CT(46)。還可見(jiàn)軸突、軸突終末、樹突和樹突棘之間的間隙填充著神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞突。此外，一些突觸性終末

14、內(nèi)含致密核芯小泡在非突觸部位緊靠軸膜分布。本研究在實(shí)際面積為108m2的照片上，對(duì)板層神經(jīng)氈單位面積內(nèi)各類突觸性終末的數(shù)目作了定量分析。組別groups例數(shù)(n)板層橫切面積(m2)crosscut area of lamina 對(duì)照組control group531.40±1.36嗎啡依賴組morphine dependent group531.20±1.24P0.05     3.1復(fù)合終末(CT)數(shù)：CT是來(lái)自背根初級(jí)傳入纖維投射到脊髓后角板層的突觸性終末，因結(jié)構(gòu)和功能的不同分為型、型和型復(fù)合終末9。從表2可見(jiàn)，嗎啡依賴組大鼠L

15、4脊髓后角板層的CT數(shù)，明顯多于對(duì)照組大鼠(多69%，P0.02)，表明嗎啡能夠促進(jìn)新的CT形成。 22)組別groups例數(shù)(n)CT數(shù)number ofCTST數(shù)number ofST突觸性終末數(shù)(CT+ST)number of synaptic terminal對(duì)照組control53.79±0.5811.38±0.5015.16±1.04嗎啡依賴組morphinedependent group56.42±0.8913.90±0.6820.33±1.39(69%)(22%)(34%)P0.020.010.014脊髓后角板層的C數(shù)

16、量與對(duì)照組大鼠比較，增多70%(P0.05，表3)，表明嗎啡能夠促進(jìn)有髓傳入纖維的側(cè)支出芽和建立新的突觸。 22)組別groups例數(shù)(n)C數(shù)number ofCC數(shù)numbdr ofCC數(shù)number ofC對(duì)照組control group52.03±0.311.12±0.210.63±0.14嗎啡依賴組morphinedependent group53.27±0.551.90±0.261.25±0.23(61%)(70%)(98%)P0.050.050.054脊髓后角板層的C數(shù)明顯比對(duì)照組大鼠增多98%(P0.05，表3)，表明

17、嗎啡能夠促進(jìn)含肽類突觸小泡的初級(jí)傳入纖維側(cè)支出芽和建立新的突觸。3.2簡(jiǎn)單終末(ST)數(shù)：表2顯示，嗎啡依賴組大鼠L4脊髓后角板層的ST數(shù)比對(duì)照組大鼠增多22%(P0.01)，表明嗎啡也能促進(jìn)來(lái)自非背根神經(jīng)纖維的側(cè)支出芽和建立新的突觸。3.3板層突觸性終末數(shù)：此突觸性終末數(shù)是指板層復(fù)合終末與簡(jiǎn)單終末相加的數(shù)目。從表2可見(jiàn)，嗎啡依賴組大鼠L4脊髓后角板層突觸性終末數(shù)，比對(duì)照組大鼠增多34%(P0.01)。 討論以往的研究結(jié)果已表明，經(jīng)過(guò)7d遞增性注射嗎啡的大鼠已對(duì)嗎啡產(chǎn)生依賴性10。本研究的實(shí)驗(yàn)組大鼠是經(jīng)歷了連續(xù)40d的嗎啡注射，因此能夠觀察到嗎啡依賴大鼠的一些行為發(fā)生異常變化。雖然每天給藥兩次

18、，但是由于兩次給藥相隔的時(shí)間為12h，動(dòng)物有可能在沒(méi)有及時(shí)得到嗎啡的情況下，腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)功能亢進(jìn)11，以及脊髓代償性建立的一些新的初級(jí)感覺(jué)傳入通路可能增加了信息的傳入。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間處于嗎啡依賴狀態(tài)的大鼠，來(lái)自背根節(jié)神經(jīng)元發(fā)出的初級(jí)傳入纖維終末與脊髓后角板層的靶神經(jīng)元建立的突觸數(shù)量明顯增多。在這些情況下，當(dāng)受到一般性刺激后，動(dòng)物有可能表現(xiàn)出躁動(dòng)或攻擊行為，如大鼠之間發(fā)生打斗或主動(dòng)攻擊鉗夾它們的器具等。這些行為可能隨著應(yīng)用嗎啡的次數(shù)增多而變得明顯。我們先前的研究報(bào)道12，嗎啡依賴大鼠靠近背根節(jié)的背根內(nèi)初級(jí)傳入纖維沒(méi)有發(fā)生側(cè)支出芽，同時(shí)也提出需要進(jìn)一步探討嗎啡依賴大鼠脊髓后角內(nèi)是否有初

19、級(jí)傳入纖維的側(cè)支出芽和建立新的突觸聯(lián)系。本研究的結(jié)果已經(jīng)對(duì)這個(gè)問(wèn)題做出了肯定的回答，并提示在嗎啡作用下，背根節(jié)神經(jīng)元發(fā)出的初級(jí)傳入纖維是在其支配的靶神經(jīng)元附近(即脊髓后角內(nèi))發(fā)生了側(cè)支出芽。至于嗎啡是如何促進(jìn)初級(jí)傳入纖維在脊髓后角板層側(cè)支出芽和建立新的突觸聯(lián)系?目前還不清楚。我們推測(cè)有兩種可能性：1.長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用嗎啡，抑制初級(jí)傳入纖維的信息輸入，使其支配的靶神經(jīng)元不斷處于功能上去神經(jīng)支配狀態(tài)，就好像結(jié)構(gòu)上去神經(jīng)支配的那樣，有可能導(dǎo)致去神經(jīng)支配的靶區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞或靶神經(jīng)元分泌一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)11，13，14，誘導(dǎo)初級(jí)傳入纖維側(cè)支出芽以及建立突觸聯(lián)系，代償靶神經(jīng)元在功能上去神經(jīng)支配的作用。2.嗎

20、啡直接作用帶有阿片受體的背根節(jié)神經(jīng)元，促使其發(fā)出的初級(jí)傳入纖維出現(xiàn)側(cè)支出芽，并與靶神經(jīng)元建立更多的突觸聯(lián)系，企擺脫嗎啡長(zhǎng)時(shí)間抑制其信息的輸入。由此可見(jiàn)，第2種可能性只能促使含有阿片受體的初級(jí)傳入纖維的突觸性終末數(shù)目增多。但實(shí)際上本研究觀察到初級(jí)傳入纖維其他類型的復(fù)合終末數(shù)目都有增加，不過(guò)有程度上的不同。我們?cè)O(shè)想，功能上去神經(jīng)支配的靶組織或細(xì)胞分泌的一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)1，可能對(duì)不同類型的初級(jí)傳入纖維的側(cè)支出芽和建立新突觸都有促進(jìn)作用。但是，各類型的初級(jí)傳入纖維終末之間在與靶神經(jīng)元建立新突觸方面可能存在競(jìng)爭(zhēng)性8。本研究結(jié)果表明，嗎啡明顯促進(jìn)含肽類神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)的突觸小泡的初級(jí)傳入纖維側(cè)支出芽

21、和建立新突觸。因?yàn)镃的數(shù)量增加將近一倍(98%)，而C和C的數(shù)量只分別增加61%和70%。一般認(rèn)為15，嗎啡能夠阻斷初級(jí)傳入纖維終末釋放P物質(zhì)，這種肽類物質(zhì)存在于含致密核芯的突觸小泡內(nèi)。在嗎啡依賴條件下，脊髓后角的微環(huán)境變化可能優(yōu)先促進(jìn)C的形成，代償這類突觸性終末對(duì)靶神經(jīng)元的影響。上述僅是我們的推測(cè)，還有待研究證實(shí)。本研究還觀察到，嗎啡依賴大鼠脊髓后角板層的簡(jiǎn)單終末(ST)數(shù)增加了22%，表明來(lái)自脊髓內(nèi)中間神經(jīng)元軸突和下行傳導(dǎo)束纖維也有可能側(cè)支出芽和建立新的突觸。其意義現(xiàn)在還不清楚，但提示了在嗎啡依賴的條件下，脊髓內(nèi)可能會(huì)形成更多的神經(jīng)環(huán)路，對(duì)嗎啡造成脊髓后角靶神經(jīng)元在功能上去神經(jīng)支配起代償作

22、用。本文16見(jiàn)插第5頁(yè)    1大鼠L4脊髓后角橫斷面的半薄切片；示()、()和()板層。甲苯胺藍(lán)染色×100Fig.1 Observation of behavior of rats in morphine dependent group(L) and control group;showing morphine dependent rats(arrowhead) were fighting each other before morphine injected    2嗎啡依賴組(L)和對(duì)照組(R)大

23、鼠的行為觀察；示在注射嗎啡前，嗎啡依賴組大鼠正在發(fā)生打斗行為(箭頭)。×100Fig.2 Crosscut area of L4 spinal dorsal horn of rat;showing lamina(),lamina() and lamina().Semithin section stained with toluidine blue ×100    3大鼠L4脊髓后角板層神經(jīng)氈，示簡(jiǎn)單終末(ST)和樹突(D)。(36，×22 667，標(biāo)尺示0.5m)Fig.3 The neuropil of lamina in

24、 L4 spinal dorsal horn of rat;showing simple terminal(ST) and dendrite(D).(Fig.3-6,×22 667,scale Bar=0.5m)    4大鼠L4脊髓后角板層神經(jīng)氈，示型復(fù)合終末(C)和樹突(D)。Fig.4 The neuropil of lamina in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type complex terminal (C) and dendrite(D).   

25、0;5大鼠L4脊髓后角板層神經(jīng)氈，示型復(fù)合終末(C)和樹突(D)。Fig.5 The neuropil of lamina in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type complex terminal (C) and dendrite(D).    6大鼠L4脊髓后角板層神經(jīng)氈，示型復(fù)合終末(C)和樹突(D)。Fig.6 The neuropil of lamina in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type complex terminal (C) and

26、dendrite(D).【基金項(xiàng)目】廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(970093)和教育部回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目【作者簡(jiǎn)介】曾園山(1955)，男(漢族)，廣東梅縣人，醫(yī)學(xué)博士，教授曾園山（中山醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室神經(jīng)科學(xué)研究室）吳金浪（電鏡室）陳穗君（中山醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室神經(jīng)科學(xué)研究室）張惠君（解剖學(xué)教研室，廣州510089）參考文獻(xiàn)1Hendry IA,Duggan AW,Hall JG.Morphine dependence in the rat:the appearance in the spinal cord of a dorsal root ganglion cell

27、 neurotrophic factorJ.J Neurosci Res,1987,18(3):439-442.2曾園山，吳良芳.嗎啡對(duì)備用根大鼠脊髓板層突觸重建的影響電鏡定量研究J.解剖學(xué)報(bào)，1993，24(2)：191196.3曾園山，吳良芳.嗎啡對(duì)備用根大鼠背根內(nèi)神經(jīng)纖維側(cè)支出芽的影響電鏡定量研究J.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1992，8(1)：5356.4曾園山，吳良芳.嗎啡對(duì)備用根大鼠脊髓板層背根終末的影響抗氟化物酸性磷酸酶組化定量研究J.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，1992，1(2)：203209.5Knyihar-Csillik E,Csillik B,Pakie P.Ultrastruc

28、ture of normal and degenerating glomerular terminals of dorsal root axons in the substantia gelationsa of the Rhesus monkeyJ. J Comp Neurol,1982,210(4):357-375.6Snyder RL.Light and electron microscopic autoradiographic study of the dorsal root projections to the cat dorsal hornJ.Neurosci,1982,7(6):1417-1437.7Ralston HJ,Ralston DP.The distribution of dorsal