石蠟組織芯片制備技術(shù)的改良

1、石蠟組織芯片制備技術(shù)的改良         08-10-31 14:37:00     作者：張可浩    編輯：studa20【摘要】  目的:探討組織芯片制備方法以及相關(guān)技術(shù)改良，提高組織芯片制備的質(zhì)量。方法:使用組織芯片空心蠟?zāi)Ｒ淮涡猿尚偷哪＞?，?yīng)用改良的組織芯片制備方法以及二次石蠟包埋技術(shù)，制作食管癌腫瘤組織芯片，常規(guī)病理石蠟切片制備組織芯片，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果:組織芯片空心蠟?zāi)Ｖ苽涑晒β蔬_(dá)100%。所制備的組織芯片石

2、蠟塊內(nèi)組織芯切片平面整齊，無(wú)組織芯倒浮現(xiàn)象。組織芯片切片中組織芯片微組織片陣列整齊，無(wú)微組織片皺褶以及微組織片脫片現(xiàn)象。組織芯片常規(guī)HE染色后，經(jīng)病理診斷醫(yī)生閱片，并與各組織芯原供體石蠟標(biāo)本常規(guī)病理HE染色片進(jìn)行對(duì)照觀察，病理診斷結(jié)果一致。結(jié)論:改良的石蠟組織芯片制備技術(shù)簡(jiǎn)單易學(xué)，操作流程容易掌握控制，提高了組織芯片制作的質(zhì)量，有利于組織芯片技術(shù)的普及和推廣應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】  組織芯片 技術(shù)改良 食管癌    組織芯片技術(shù)是繼基因芯片、蛋白質(zhì)芯片后又一重要的生物芯片技術(shù)平臺(tái)，它是將數(shù)十個(gè)甚至數(shù)千個(gè)不同個(gè)體的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上所形成的組織微陣列

3、1。組織芯片作為一種高通量、大樣本以及快速的生物分子水平研究分析工具，克服了傳統(tǒng)病理學(xué)方法和基因芯片技術(shù)中存在的某些缺陷，在醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮了愈來(lái)愈重要的作用，對(duì)于疾病的分子診斷，預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)的定位、抗體和藥物篩選等均有十分重要的實(shí)用價(jià)值，是疾病研究從基礎(chǔ)研究走向臨床應(yīng)用研究重要的橋梁2-6。本研究針對(duì)現(xiàn)有組織芯片制備過(guò)程中存在的一些不足，如組織芯片空心蠟?zāi)Ｖ苽洳僮鞒绦蜉^為繁瑣以及組織芯片石蠟塊二次包埋質(zhì)量欠佳等，研究探索出一種行之有效的組織芯片制備方法，有利于組織芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床、病理學(xué)等研究領(lǐng)域的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。    1  材料和

4、方法    1.1  材料  收集溫州醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)州醫(yī)院2004年9月至2007年2月間手術(shù)離體食管癌組織標(biāo)本30例。對(duì)組織標(biāo)本手術(shù)切緣至癌灶部全程黏膜組織以及癌灶組織進(jìn)行取材，分段處理。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片以及組織病理學(xué)檢查證實(shí)。每例食管癌組織標(biāo)本均包含有：癌組織、不典型增生以及正常食管黏膜組織。石蠟切片機(jī)（leica RM 2135）、一次性石蠟切片刀片均購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。組織芯片制備系統(tǒng)（HT-1）購(gòu)自朝陽(yáng)恒泰科技發(fā)展有限責(zé)任公司。    1.2  制作組織芯片空心蠟

5、模  利用組織芯片空心蠟?zāi)３尚湍＞?，一次成型制作組織芯片空心蠟?zāi)?，具體操作如下：將石蠟放入組織芯片制備系統(tǒng)熔蠟盤內(nèi)加熱熔化，熔蠟盤內(nèi)放入一片適當(dāng)大小的硬質(zhì)光面塑料薄板。將空心蠟?zāi)３尚涂虼罂诔缕椒庞谌巯灡P中的塑料薄板上，調(diào)整熔蠟盤內(nèi)石蠟的量，使熔化石蠟平面高出空心蠟?zāi)３尚涂蚣s2 mm。將無(wú)刃陣列管針管口朝下放置于組織芯片制備系統(tǒng)加熱板上預(yù)熱（70 ）約10 min，平穩(wěn)垂直插入上述空心蠟?zāi)３尚涂?。平穩(wěn)移開(kāi)熔蠟盤，室溫冷卻石蠟數(shù)分鐘，熔蠟盤中石蠟呈半凝狀態(tài)時(shí)，下壓空心蠟?zāi)３尚涂蚧顒?dòng)頂板，使其貼近蠟?zāi)３尚涂?。用小刀將空心蠟?zāi)３尚涂蛩闹苁瀯濍x，繼續(xù)室溫冷卻石蠟數(shù)分鐘，熔蠟盤中不再有任何能

6、流動(dòng)的液體狀石蠟。將熔蠟盤放回組織芯片制備儀上加溫?cái)?shù)秒鐘，熔蠟盤底部石蠟開(kāi)始熔化時(shí)迅速整體移除陣列管針、蠟?zāi)３尚涂?、蠟?zāi)３尚涂騼?nèi)的蠟?zāi)?。插入陣列管針針芯，推出并去除進(jìn)入陣列管針內(nèi)的石蠟，拔除陣列管針針芯，去除蠟?zāi)３尚涂蛲獠繗埩舻氖?。使用組織芯片空心蠟?zāi)０文Ｑb置，均勻拔除陣列管針，去除蠟?zāi)３尚涂蚧顒?dòng)頂板以及蠟?zāi)３尚涂蛑苓厷埩舻氖?。組織芯片空心蠟?zāi)Ｖ苽渫戤叄ㄒ?jiàn)圖1）。組織芯片空心蠟?zāi)o(wú)需從蠟?zāi)３尚涂蛑腥〕觥?#160;   1.3  制作組織芯片石蠟塊  目標(biāo)組織定位：組織芯片供體蠟塊常規(guī)病理切片1張，片厚4m，常規(guī)HE染色后進(jìn)行組織病理診斷閱片，在組織

7、切片的指引下，對(duì)相應(yīng)供體蠟塊進(jìn)行目標(biāo)組織定位標(biāo)記。組織芯片蠟芯取材與點(diǎn)樣：將蠟塊放入適當(dāng)溫度的熱水中預(yù)熱軟化片刻，應(yīng)用組織芯片制備系統(tǒng)的芯片石蠟組織芯取樣器鉆取目標(biāo)組織柱。目標(biāo)組織柱逐一點(diǎn)樣于組織芯片空心蠟?zāi)Ｖ兄付ǖ奈恢谩Ｓ脤?shí)心單針逐一將目標(biāo)組織柱輕輕壓平，使其處于同一切片平面。將裝滿組織芯的蠟?zāi)Ｆ叫幸浦烈粔K薄銅板上，加熱銅板數(shù)秒至貼近銅板的蠟?zāi)Ｉ约尤刍?，迅速移除銅板，室溫冷卻數(shù)秒后去除銅板。二次包埋組織芯片石蠟塊：芯片組織面朝下，將點(diǎn)好樣的組織芯片蠟塊連同蠟?zāi)３尚涂蚍湃胧⒂猩倭咳刍灥娜巯灡P中（熔化石蠟的深度約4 mm），數(shù)秒種后即可肉眼觀察到熔化的石蠟浸入到石蠟組織芯與蠟?zāi)？椎拈g隙。移除

8、熔蠟盤，將塑料石蠟包埋盒放于蠟?zāi)３尚涂蛏?，用小勺舀取熔化的石蠟倒入包埋盒中，室溫冷卻數(shù)分鐘，石蠟半凝狀態(tài)時(shí)用小刀劃離蠟?zāi)３尚涂蛑車氖?。石蠟完全凝固后，?fù)加熱熔蠟盤移除二次包埋好的組織芯片石蠟塊。去除蠟?zāi)３尚涂蛞约八芰鲜灠窈兄苓厷埩羰?，輪流加熱蠟?zāi)３尚涂蛩闹苓吙?，使緊貼其邊框內(nèi)側(cè)的石蠟熔化，取出成型的組織芯片石蠟塊（見(jiàn)圖1E）。    1.4  組織芯片切片制作及其應(yīng)用  應(yīng)用常規(guī)病理切片技術(shù)制作組織芯片石蠟切片，根據(jù)不同的研究目的，將組織芯片石蠟切片鋪于凈潔的或經(jīng)過(guò)其他特殊處理的載玻片上（見(jiàn)圖2），繼續(xù)應(yīng)用于常規(guī)HE染色、免疫組織化學(xué)

9、染色以及原位雜交等細(xì)胞學(xué)或分子生物學(xué)檢測(cè)。    2  結(jié)果    2.1  組織芯片石蠟塊  所制備的組織芯片空心蠟?zāi)?nèi)無(wú)空泡，無(wú)裂痕，陣列孔均一整齊，無(wú)變形，空心蠟?zāi)Ｖ苽溥^(guò)程中無(wú)廢模出現(xiàn)，蠟?zāi)Ｖ苽涑晒β蔬_(dá)100%。所制備的組織芯片石蠟塊內(nèi)組織芯切片平面整齊，無(wú)組織芯倒浮現(xiàn)象。    2.2  組織芯片  組織芯片肉眼觀察：石蠟切片中組織芯片微組織片陣列整齊，無(wú)微組織片皺褶以及微組織片脫片現(xiàn)象。組織芯片光學(xué)顯微鏡觀察：組織芯片常規(guī)HE染色后，經(jīng)病理診斷醫(yī)

10、生閱片，并與各組織芯原供體石蠟標(biāo)本常規(guī)病理HE染色片進(jìn)行對(duì)照觀察，病理診斷結(jié)果一致。表明所制作的組織芯片取材的準(zhǔn)確性高，能滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究需要。    3  討論    1986年Battifora7首先在Lab Invest發(fā)表文章，創(chuàng)立了組織芯片的雛形。1998年，Kononen等1首先提出了組織芯片（Tissue microarrays）的概念，即將數(shù)十個(gè)甚至數(shù)千個(gè)不同個(gè)體的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上形成組織微陣列生物芯片，此項(xiàng)研究突破了單一的腫瘤基因芯片表達(dá)譜研究模式，開(kāi)始結(jié)合細(xì)胞和組織水平的高通量技術(shù)。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域于是有了一種新的高通量、大樣本的快速分析工具。組織芯片將眾多樣本放在同一切片上，同化了實(shí)驗(yàn)條件，減少了因