針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響

1、針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響                        【摘要】 目的 研究針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響。方法 建立大鼠中動脈阻塞再灌注模型(MCAO)，應(yīng)用TUNEL法觀察神經(jīng)元凋亡，免疫組織化學法檢測Caspase3蛋白表達。結(jié)果 腦缺血再灌注后應(yīng)用針刺療法能夠降低大鼠神經(jīng)細胞受損后出現(xiàn)的Caspa

2、se3蛋白表達，并能減輕神經(jīng)細胞凋亡。結(jié)論 針刺療法能通過有效的抑制腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)細胞的凋亡起到腦保護作用。 【關(guān)鍵詞】 Caspase3蛋白;針刺;腦缺血再灌注損傷;細胞凋亡KEY WORDS：Caspase3 protein;Acupuncture;Cerebral ischenmiareperfusion injury;Apoptosis缺血性腦血管病是一種嚴重危害人體健康的常見病，損傷級聯(lián)反應(yīng)是近幾年關(guān)于該病研究較多的理論之一1。本實驗應(yīng)用線栓法制備的大鼠局灶性腦缺血與再灌注模型，通過針刺多個穴位，觀察神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase3的表達變化，進一步探討針刺保護腦缺血后神

3、經(jīng)細胞損傷的作用機制。1 材料與方法1.1 實驗動物及分組實驗用健康wistar大鼠30只，體質(zhì)量150300g，雌雄不拘，由華中理工大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。采用10%水合氯醛溶液，按 3ml/kg的劑量進行腹腔麻醉后備用。實驗動物隨機分為3組：對照組、模型組、針刺組，每組各10只。1.2 動物模型制備按照文獻2采用改良血管內(nèi)栓線技術(shù)制備大鼠局灶性腦缺血與再灌注損傷模型。常規(guī)去毛消毒后，頸部正中切開，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)，分離頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，電熱燒灼器燒斷ECA的分支，結(jié)扎并游離ECA主干一段，沿ICA向下分離翼顎動脈，穿線沿起點結(jié)扎。在ECA游離段上剪開

4、一小口，插入尖端用火燒圓的4.0單尼龍絲線，輕推尾端使之由ECA通過分叉部進入ICA，由入口計算長度約18mm，栓塞右大腦中動脈。栓塞30min后拉出尼龍線至ECA結(jié)扎端，使血流再灌注，縫合切口。術(shù)后動物保溫喂養(yǎng)(1820)并進行神經(jīng)體征觀察，大鼠有"三偏征"體征，確認模型制作成功。針刺治療后處死動物并提取腦組織，TUNEL法觀察神經(jīng)元凋亡，免疫組化法觀察Caspase3蛋白表達。1.3 針刺方法全部穴位根據(jù)中國針灸學會實驗針灸研究會制訂的“動物針灸穴位圖譜”取穴。針刺組取穴“中脘、天樞、氣海、血海、三陰交、豐隆、合谷、太沖、百會”進行針刺，其中“中脘、氣海”用提插捻轉(zhuǎn)補瀉

5、的補法，“天樞、血海、三陰交”用平補平瀉法，“豐隆、百會、合谷、太沖”用提插捻轉(zhuǎn)補瀉的瀉法，均留針30min，其間每10min行針1次。造模后針刺治療1次，以后每12h治療1次，共治療3次，至24h取材。1.4 標本制作及組織學評價實驗動物按時斷頭取腦，腦組織經(jīng)4%中性多聚甲醛固定2h后，脫水，常規(guī)石蠟包埋，自視交叉處向后冠狀切片，片厚4m，每只動物連續(xù)切5張。采用TUNEL法(試劑盒購買于Roche公司，貨號1684817)對動物腦組織切片進行染色，以神經(jīng)細胞核染成黃色或棕黃色為陽性。凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)是指每張腦組織切片中至少500個細胞中出現(xiàn)的凋亡細胞百分數(shù)。

6、采用抗Caspase3多克隆抗體(試劑盒購買于Neomarkers公司，CPP32,Ab4)進行免疫組化染色，并用一個評分量化表3評價各組Caspase3的表達程度。評分標準為0(無表達)、1(陽性)、2(強陽性)。1.5 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，凋亡指數(shù)用(±s)%表示。行方差分析及非參數(shù)檢驗。以P<0.05為有顯著性差異。2. 結(jié) 果2.1 神經(jīng)細胞的Caspase3表達模型組神經(jīng)細胞Caspase3表達比對照組明顯，P<0.01;而針刺組較模型組Caspase3表達顯著下降，P<0.01。(表1)表 1 wistar大鼠神經(jīng)細胞C

7、aspase3表達與對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，P<0.01                             2.2 神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)的比較對照組未見神經(jīng)細胞凋亡，模型組和針刺組神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)分別為(79.64±4.53)%和(52.88±9.59)%，與對照組相

8、比模型組神經(jīng)細胞凋亡明顯(P<0.01)，而針刺組神經(jīng)細胞凋亡與模型組比較明顯減輕(P<0.01)。3 討 論細胞凋亡是一種生理條件下的細胞死亡模式，有核細胞在一定條件下通過啟動自身內(nèi)部機制激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶而發(fā)生細胞的自然死亡。目前在研究細胞凋亡過程中最受關(guān)注的是線粒體作用、蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)(Caspase casecade)和各種死亡基因及其產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用。其中研究最多的是Caspase蛋白酶在細胞凋亡中的作用。Caspase家族被認為是細胞凋亡不可逆的進入最后實施階段的關(guān)鍵酶，而分布廣泛的Caspase3是研究較多的Caspase蛋白酶。已經(jīng)證實，在脊髓損傷的實驗?zāi)Ｐ椭校?/p>

9、用特異性的Caspase3抑制劑能夠有效的抑制凋亡4。本實驗發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注后應(yīng)用針刺療法能夠降低大鼠神經(jīng)細胞受損后出現(xiàn)的Caspase3表達，并減輕了神經(jīng)細胞凋亡，起到了腦保護作用。缺血性卒中在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中被認為是正氣不足，痰瘀中阻，多由風陽暴升、痰火相夾、血氣上攻、陰陽失調(diào)及痰蒙心竅所致，其治療當以通腑醒神，補氣活血為大法5。而本實驗針刺取穴三組。其中氣海合天樞、中脘調(diào)暢中焦，通腑理氣;氣海合血海、三陰交以補氣養(yǎng)血活血、通經(jīng)活絡(luò);瀉豐隆以祛痰;重刺百會、合谷、太沖以開竅閉、醒神智。諸穴合用，共達啟閉開竅、降火豁痰、通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)和陰陽之功效。本實驗結(jié)果提示，針刺對大鼠局灶性腦缺血再灌注

10、損傷有保護作用，其作用機制可能是降低了神經(jīng)細胞受損后出現(xiàn)的Caspase3表達，是否還有其他途徑發(fā)揮保護作用有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】 1廖維靖，F(xiàn)rank Wieg，Ulrich Dirnag1.腦缺血損傷的病理生理機制損傷級聯(lián)反應(yīng)J.國外醫(yī)學腦血管疾病分冊，1998，6(4)：1972Buchan AM，Slivka A，Xue D.The effect of the NM DA receptor antagonist MK801 on cerebral blood flow and infarct，volume in experimental focai strokeJ.Brain Res，1992，574(2)：17l3Hisanobu T，Ohkuma H，Suzuki S.Effects of thrombin inhibitor on thrombinrelated signal transduction and cerebral vasospasm in the rabbit subarachnoid hemorhagemodelJ.Stroke，2003，34(6)：14974Akin E，Clower B，Tibbs R，et al.Bilirubinproduces apoptosisi