探究組織型纖溶酶原激活因子對(duì)生物材料表面血小板黏附的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)

1、探究組織型纖溶酶原激活因子對(duì)生物材料表面血小板黏附的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)    【摘要】  目的  本文觀察組織型纖溶酶原激活因子（t-PA）包被Dacron和PTEE材料對(duì)表面血小板黏附的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。方法  通過(guò)體內(nèi)和體外動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，觀察血小板在材料表面的黏附情況和對(duì)機(jī)體內(nèi)血小板黏附的影響。結(jié)果  通過(guò)t-PA處理后，上述兩種材料表面的血小板黏附數(shù)目較對(duì)照組明顯減少（P0.01），機(jī)體內(nèi)血小板黏附也較空白組明顯減少 （P0.01）。結(jié)論  t-

2、PA可通過(guò)抑制血小板在材料表面的黏附，進(jìn)而推斷可以用于防治生物材料的細(xì)菌黏附。組織型纖溶酶原激活因子（t-PA）具有特異的溶栓作用。        【關(guān)鍵詞】  組織型纖溶酶原激活因子(t-PA)；包被Dacron；PTEE；表面血小板  前言      近年來(lái)的很多研究表明Lin TL，Lu FM，Sheu MS. Antimicrobial coatings:&#

3、160;A remedy for medical device-related infections. Med Dev Tech，2001，在由生物材料引發(fā)的感染（biomaterial centered infection，BCI）中，45%的原因是因?yàn)樯锊牧吓c人體接觸時(shí)，血液和組織中的纖維粘連蛋白（fibronectin）、玻璃粘連蛋白（vitronectin）和纖維蛋白原（fibrinogen）會(huì)吸附在材料表面，形成一層蛋白膜，而細(xì)菌很容易在這層蛋白膜上黏附，繼而生長(zhǎng)繁殖，逐漸形成一層頑

4、固的水合多聚糖性質(zhì)的生物活性膜（biofilm）1。這層生物膜可以吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有一定厚度，產(chǎn)生很強(qiáng)的抗藥能力，傳統(tǒng)的抗菌治療是無(wú)法根除的。根據(jù)細(xì)菌性感染的機(jī)理，本文就t-PA對(duì)生物材料表面血小板黏附的作用及影響進(jìn)行初步探討。        1  實(shí)驗(yàn)材料與方法        1.1  材料和儀器  滌綸（Dacron）B型（蘇州華明織帶有限公司），膨體聚四氟乙烯（PTEE，

5、美國(guó)Gore&Associates公司）。谷胱苷肽硫基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-trasferase，GST）和GST-t-PA融合蛋白由實(shí)驗(yàn)室制備，液體培養(yǎng)基（法國(guó)生物梅里埃公司）。        1.2  材料的包被  將Dacron和PTEE薄膜剪裁成96孔酶標(biāo)板等大的原片，用蒸餾水充分漂洗干凈后在70%的酒精中浸泡30min，無(wú)菌條件下取出、晾干，置入96孔板中，每種材料分成3組，每孔分別加入100l含0.5mg/ml GST-t-PA的T

6、ris-HCl緩沖液（pH8.0）或含0.5mg/ml GST的Tris-HCl緩沖液或單純的Tris-HCl緩沖液，4放置過(guò)夜，棄去上清液，用Tris-HCl緩沖液（50mM Tris-HCl，pH8.0/120mM NaCl）輕輕漂洗兩次移入新的96孔板孔中備用。        1.3  材料植入動(dòng)物模型的制作  2.53.0kg雄性新西蘭大耳白兔72只（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），隨機(jī)分為3組(各組24只)：空白對(duì)照組，GST蛋白組和GS

7、T-t-PA蛋白組，每組又分為兩組，D組（放置Dacron片）和PEET組(放置PEET片)。        動(dòng)物稱(chēng)重后，2%戊巴比妥鈉（35mg/kg）耳緣靜脈麻醉動(dòng)物，備皮消毒后沿股動(dòng)脈走向切開(kāi)皮膚，分離出兩側(cè)的股動(dòng)脈和股靜脈，結(jié)扎股動(dòng)脈的側(cè)枝循環(huán)，經(jīng)股靜脈注射肝素(10U/kg體重)，5min后從兩端夾閉股動(dòng)脈，其間間隔不小于6cm，用眼科剪剪開(kāi)0.3cm左右的縱口，用生理鹽水將血管內(nèi)的血液沖洗干凈，然后放入經(jīng)GST蛋白或GST-t-PA蛋白包被處理的兩種滌綸材料膜片，空白組進(jìn)行手術(shù)后血管縫合，不予以任何處理

8、。用3-0聚丙烯線縫合血管，移去動(dòng)脈夾使血流再通，密切觀察手術(shù)處股動(dòng)脈搏動(dòng)情況。麻醉恢復(fù)后，正常飼養(yǎng)。于術(shù)后第2天，每組隨機(jī)選8只行血小板沉積實(shí)驗(yàn)。        1.4  血小板在材料表面黏附的觀察（體外實(shí)驗(yàn)）  取空白組新鮮兔動(dòng)脈血，按91的比例與3.8%的枸櫞酸鈉溶液混勻，離心分離富含血小板的血漿，用PBS將血小板數(shù)目調(diào)節(jié)至106/ml，取150l加到上述處理的材料表面然后于37放置30min，棄取血漿，用PBS將材料膜片輕輕漂洗3遍后用2.5%的戊二醛固定2h，經(jīng)冷凍

9、干燥后進(jìn)行掃描電鏡觀察。隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。        1.5  對(duì)機(jī)體內(nèi)血小板黏附的觀察（在體實(shí)驗(yàn)）  在植入物后2天，各組8只動(dòng)物按前述方法麻醉，常規(guī)分離提取血小板，于血小板懸液內(nèi)逐漸滴加Cr51鉻酸鈉溶液18.5MBq（0.5mCi）。將51Cr標(biāo)記的血小板懸液2ml經(jīng)股靜脈注入體內(nèi)，1h后取出移植材料，用PBS輕輕沖洗，并置于記數(shù)井中記數(shù)，同時(shí)抽取全血標(biāo)本確定以確定游離和細(xì)胞51Cr活性，測(cè)定血小板計(jì)數(shù)和凝血酶原時(shí)間(PT)。  &

10、#160;     2  結(jié)果        2.1  血小板在材料表面黏附的觀察（體外實(shí)驗(yàn)）  結(jié)果顯示，用t-PA重組蛋白及GST蛋白處理醫(yī)用Dacron及PEEP片，可明顯抑制血小板在其表面的粘附，對(duì)Dacron片，用GST包被使其表面的血小板數(shù)目比對(duì)照組減少了大約42.3%(P0.01)；而TFPI重組蛋白處理組的血小板粘附數(shù)目減少更為明顯，與對(duì)照組相比減少了大約76.4%(P0.01)。在聚氯乙烯

11、材料的實(shí)驗(yàn)中，也得到了類(lèi)似的結(jié)果，其中GST處理的材料表面的血小板數(shù)目比對(duì)照組減少了大約34.1%(P0.05)；TFPI重組蛋白比對(duì)照組則減少了大約74.8% (P0.01)。在兩種材料的實(shí)驗(yàn)中GST組與TFPI重組蛋白組之間相比都有明顯的差異(P0.05) (見(jiàn)圖1)。  圖1    2.2  在體實(shí)驗(yàn)中機(jī)體內(nèi)血小板沉積的影響  在體實(shí)驗(yàn)研究表明，Dacron組中，GST-tPA組血管血小板沉積明顯少于GST組和空白對(duì)照組載體組和空白對(duì)照組，（P0.05）；PEEP組也得

12、出相同的結(jié)論。見(jiàn)表1。表1  體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不同材料的各組的血小板沉積的比較注：和對(duì)照組相比，*P0.05；和對(duì)照組相比，*P0.01        3  討論        生物膜是一種黏附于非生物或生物表面的微生物菌落，它們包裹與它們自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）中，是微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中為了適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種與浮游細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的存在，而多數(shù)生物膜細(xì)胞的感染與生物醫(yī)學(xué)材料（如導(dǎo)管、人工心瓣膜和置

13、換關(guān)節(jié)等）的應(yīng)用密切相關(guān)。生物材料植入感染是生物材料臨床應(yīng)用所面臨的嚴(yán)重問(wèn)題，極大地限制了生物材料的臨床應(yīng)用和推廣。有統(tǒng)計(jì)分析生物材料中心感染（BCI）發(fā)病率有上升趨勢(shì)，占美國(guó)醫(yī)院內(nèi)感染的45%，死亡率為5%60%。人工血管移植和人工機(jī)械瓣膜置換術(shù)后感染發(fā)生率高達(dá)1%9%，死亡率3%60%。        根據(jù)細(xì)菌性感染的機(jī)理，目前人們通過(guò)2種方式進(jìn)行抗菌：一是對(duì)材料表面改性，阻止細(xì)菌黏附在材料表面；二是依靠靜電作用使菌體被吸附到帶正電荷的材料表面，通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞膜的組成取得殺菌效果。體內(nèi)植入材料表面激活了血小板。由于體內(nèi)植入材料表面激活了血小