急性放射對小鼠骨髓造血細胞及基質細胞層粘附功能的影響

1、    急性放射對小鼠骨髓造血細胞及基質細胞層粘附功能的影響        骨髓造血干細胞的自我復制、增殖、更新、維持正常造血功能，是通過造血干細胞表面的粘附分子與基質細胞上的配體或細胞外基質蛋白結合而實現(xiàn)的1。我們觀察8Gy 60Co 射線照射對小鼠骨髓造血細胞與體外培養(yǎng)的骨髓基質細胞層粘附能力的影響，以進一步探討急性放射損傷引起骨髓造血抑制的原因。 材料和方法1實驗動物清潔級昆明小鼠24只，同批鼠齡78周，體重1820g，雌雄各半，由同濟醫(yī)科大學動物中心提供，隨機分為照射

2、組與非照射組，每組12只。2照射劑量60 Co 射線一次全身均勻照射，每只小鼠吸收劑量為8Gy，吸收劑量率為0.43Gy/min。3外周血白細胞計數(shù)和骨髓有核細胞計數(shù)照射后7天從尾靜脈取血，采用標準方法計數(shù)外周血白細胞。取小鼠雙側股骨，用RPMI 1640液沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞并用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞層，洗滌2次，加入適量培養(yǎng)液充分混勻，制成懸液，用臺盼藍鑒定細胞活性在95%以上，計數(shù)骨髓有核細胞數(shù)。4骨髓成纖維祖細胞(CFU-F)培養(yǎng)按常規(guī)方法2：建立CFU-F培養(yǎng)體系，再加已制備好的骨髓細胞懸液，使細胞濃度達2×106/ml。將上述細胞懸液1ml接種于24孔培養(yǎng)板中

3、，置于37含7%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周半量換液一次。1214天于倒置顯微境下計數(shù)成纖維細胞集落，第4周基質細胞層形成后作粘附能力測定。5骨髓有核細胞對骨髓基質細胞層粘附能力的測定28天基質細胞層形成后，用RPMI 1640液輕輕沖洗2次以棄去懸浮細胞，在培養(yǎng)的基質細胞層中，加入濃度為5×106/ml的小鼠骨髓有核細胞懸液1ml(含20%小牛血清)。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時后，用RPMI 1640培養(yǎng)液輕輕沖洗2次，收集并計數(shù)未粘附的骨髓有核細胞，骨髓有核細胞對骨髓培養(yǎng)基質細胞層的粘附能力(1-未粘附細胞數(shù)/5×106)×100%。6統(tǒng)計學方法采用t檢驗。結果

4、1各組外周血白細胞及骨髓有核細胞數(shù)比較照射組外周血白細胞計數(shù)與骨髓有核細胞數(shù)均顯著低于未照射組(附表)。附表組別鼠數(shù)WBC(×109/L)骨髓有核細胞(×107/根股骨)未照射組127.05±0.451.71±0.03照射組121.91±0.11*0.87±0.10*     * 與未照射組相比，P0.01 2急性放射對小鼠成纖維細胞集落的影響未照射組小鼠成纖維細胞集落數(shù)為95.0±7.5，照射組為38.4±3.1，兩組相比有顯著性差異(P0.01)。3急性放射對小鼠骨髓有核

5、細胞及骨髓基質細胞層粘附能力的影響照射組基質細胞層對未照射組骨髓有核細胞粘附能力(47.61%±4.30%)及照射組骨髓有核細胞對未照射組基質細胞層粘附能力(51.15%±6.00%)均顯著低于未照射組有核細胞對未照射基質細胞層粘附能力(69.51%±5.57%)，差異有顯著性(P0.01)。討論本實驗中小鼠經(jīng)8Gy 射線照射后7天，其外周血白細胞計數(shù)及骨髓有核細胞計數(shù)較未照射組顯著下降，說明成功地建立了急性放射損傷小鼠模型。我們用改良的Dexter長期骨髓培養(yǎng)方法觀察急性放射損傷對小鼠骨髓基質細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)照射組小鼠成纖維細胞集落平均數(shù)顯著低于未照射組平均

6、數(shù)，由于成纖維細胞是基質細胞的主要成分之一，該結果提示，基質細胞的抗輻射能力是有限的，60Co射線8Gy可損傷和抑制小鼠基質細胞的生長。我們將未照射組小鼠的骨髓有核細胞分別加入到照射組與未照射組的體外培養(yǎng)基質細胞層上，照射組基質細胞層對骨髓有核細胞的粘附能力明顯低于未照射組，從而提示放射損傷了骨髓造血基質，使造血基質對造血細胞粘附能力下降。而將照射組小鼠骨髓有核細胞加入到未照射組小鼠體外培養(yǎng)的基質細胞層上，照射組小鼠骨髓有核細胞對未照射組基質細胞層的粘附能力明顯低于未照射組小鼠骨髓有核細胞對未照射組基質細胞層的粘附能力。說明急性放射損傷了造血細胞的粘附能力。本實驗說明急性放射不僅抑制基質細胞生

7、長，而且損傷造血細胞與造血基質的粘附能力，培養(yǎng)的骨髓基質細胞層的粘附能力受基質細胞數(shù)量、基質細胞表達的粘附分子及其分泌的基質蛋白影響，因此，我們將進一步用流式細胞儀檢測基質細胞表面粘附分子的表達。骨髓正常造血有賴于造血細胞與基質的直接粘附作用，這種粘附作用由造血細胞及基質細胞表面的粘附分子和基質蛋白介導，它不僅影響造血細胞在骨髓微環(huán)境中遷移、分化、增殖，而且影響細胞因子分泌與釋放3，因此，無論是骨髓造血細胞粘附能力改變，還是造血基質粘附能力的改變，都會損傷骨髓造血功能。經(jīng)靜脈注射的骨髓干細胞移植最終歸巢于骨髓，定位于骨髓后增殖，分化，成熟，并再次釋放入外周血循環(huán)，該過程都需要干細胞與骨髓基質的粘附作用。在臨床上