淺論血管緊張素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞纖維連接蛋白合成的影響

1、淺論血管緊張素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞纖維連接蛋白合成的影響 09-08-03 16:48:00 編輯：studa090420 作者：陳艷清李世榮曹川馮智夏珊李丹論文關(guān)鍵詞血管緊張素；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；纖維連接蛋白 論文摘要目的：探討血管緊張素(Ang)及其型、型受體阻斷劑和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸激酶(CaN)的阻滯劑環(huán)胞素A(CsA)對(duì)增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞纖維連接蛋白mRNA和蛋白表達(dá)的作用。方法：體外分離培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，分別將一定濃度的Ang (10-9-10-5l/L)，和Ang 10-6mmol/L加上不同阻滯劑losartan、PD123319、環(huán)胞素A

2、(濃度均為10-5mmol/L)加入細(xì)胞培養(yǎng)液中刺激48h，分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Westernblot印跡方法檢測(cè)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞纖維連接蛋白(FN)的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：體外成功地培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。經(jīng)Ang 刺激48h后，F(xiàn)N mRNA和蛋白表達(dá)量明顯增高，增高程度與AngII濃度呈正比；加入losaartan和環(huán)胞素A后，F(xiàn)N原mRNA和蛋白表達(dá)量較單用Ang組下降，而加入PD123319后，F(xiàn)NmRNA和蛋白表達(dá)量較單用Ang組無明顯改變。結(jié)論：Ang 可促增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的FN合成，可能在增生性瘢痕的發(fā)展過程中起重要作用，該作用主要通過An

3、g的型受體介導(dǎo)完成，該作用可能與CaN信號(hào)通路有關(guān)。 增生性瘢痕是以成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為主要特征的結(jié)締組織疾病。其發(fā)病機(jī)制至今尚未徹底闡明。血管緊張素(angiotensin ，Ang )作為腎素一血管緊張素系統(tǒng)中重要的因子，其經(jīng)典作用是引起血管收縮和調(diào)節(jié)水鹽平衡。近來研究認(rèn)為，Ang 作為一種生長因子，是一種強(qiáng)烈的促有絲分裂原，在促進(jìn)心肌間質(zhì)、腎臟間質(zhì)、肺間質(zhì)以及血管壁纖維化的過程中發(fā)揮重要作用。纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)為一種大分子非膠原糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察Ang 及其受體拮抗劑、CsA對(duì)成纖維細(xì)胞合成FN的影響。

4、1材料和方法 11主要試劑：Ang (美國Anaspec)；Losartan、PDl23319、csA(美國sigma)；大鼠抗人FN抗體(美國Neomarkers)；兔抗大鼠IgG(北京中杉)；DMFM培養(yǎng)基(美國Hyclone)；胎牛血清(美國Hyclone)；醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司YJ-875型)；CO2培養(yǎng)箱(美國SHELLABl815TC型)。 12取材標(biāo)準(zhǔn)：增生性瘢痕，瘢痕色澤紅，質(zhì)硬，高出皮膚表面，均為燒傷創(chuàng)面愈合已超過3個(gè)月，但瘢痕仍持續(xù)增生，瘢痕局部無感染和潰瘍，均未曾使用抗瘢痕藥物、彈力加壓、放療等方法治療；病人無高血壓、肝硬化、肺纖維化、慢性腎炎、心肌梗塞等疾病

5、；病人無全身感染、腫瘤；無結(jié)締組織疾病或可能影響結(jié)締組織代謝的疾病，未進(jìn)行過全身應(yīng)用皮質(zhì)類固醇等藥物治療。 13成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)：采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，將手術(shù)中切下的符合條件的增生性瘢痕在無菌條件下切除其表皮，在少量胎牛血清中將標(biāo)本切成1mm3左右的組織塊置于培養(yǎng)瓶中，在95空氣、5CO2、37、飽和濕度條件下培養(yǎng)6-8h，使組織塊牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基適量，繼續(xù)培養(yǎng)，3-4天換液1次，2-3周后，原代細(xì)胞生長成單層，用0.25胰蛋白酶消化后，按1:3的比例傳代培養(yǎng)，此后每2-3天換液1次，每45天分種傳代1次，實(shí)驗(yàn)用第3-5代細(xì)胞。 14 實(shí)驗(yàn)分組

6、：實(shí)驗(yàn)分為四組：對(duì)照組：10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；Ang 組：培養(yǎng)液中加入Ang ，濃度范圍(10-9 mol/L-10-5mol/L)；Ang +洛沙坦(losartan)組：培養(yǎng)液中同時(shí)加入Ang (10-6mol/L)合losartan(10-5mol/L)；Ang +PDl23319組：培養(yǎng)液中同時(shí)加入Ang (10-6mol/L)和PDl233 19(10-5mol/L)；Ang +CsA組培養(yǎng)液中同時(shí)加入Ang (10-6mol/L)合CsA(10-5mol/L)。 15 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)FN的mRNA的表達(dá)：選取生長較好的成纖維細(xì)胞，采用Trizol法提

7、取細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)量總RNA的濃度和純度，-80保存。按照試劑盒操作說明，根據(jù)FN的相應(yīng)基因序列合成引物，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR法擴(kuò)增。FN的引物設(shè)計(jì)：上游引物序列：5-GAT GTG ATG TCG ATT CCA T一3下游引物序列：5-GAT CT C TGG TCC ATG AAG AT-3，擴(kuò)增片段為1107bp。內(nèi)參照-actin引物上游序列5-GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG ACA-3，下游序列為：5-GCA CGA AGG CTC ATC ATT CAAAA-3，產(chǎn)物446bp。引物由北京華大基因合成。RT-PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性

8、3min，然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)：94 lmin，57退火lmin，72lmin。循環(huán)完畢，72延伸7min。1.5瓊脂糖膠上電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并攝像。用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)目的基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行灰度測(cè)定，采用4.1版本Quantity One軟件(Bio-Rad)分析各條帶光密度值與內(nèi)參片段的面積灰度比值，基因表達(dá)量以該比值來表示。16 Western blot檢測(cè)FN蛋白表達(dá)：細(xì)胞用SDS溶液裂解后，離心取上清。蛋白濃度采用BCA法測(cè)定。取50g蛋白，經(jīng)SDS-PAGE(12分離膠，4積層膠)分離后，采用半干電轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含有5BSA的TBST封閉后，加入1:500稀

9、釋的抗AT1、AT2抗體和抗-actin抗體于室溫下孵育2h，隨后加入1:300稀釋的二抗于室溫孵育1h，最后加入ECL試劑顯影。采用4.1版本Ouantity One軟件(Bio-Rad)分析各條帶光密度值，-actin蛋白表達(dá)作為內(nèi)參照。 17 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。數(shù)據(jù)以(xs)表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)、相關(guān)分析及多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與同一對(duì)照組的比較的方差分析，P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2結(jié)果 21不同濃度Ang 作用于成纖維細(xì)胞后FN的mRNA表達(dá)結(jié)果：總RNA在260和280nm波長下的吸光度比值大于1.8。甲醛變性提示mRNA表達(dá)完整，可用于半定量分析。AngII濃度為10-8mol/L時(shí)，F(xiàn)N的mRNA表達(dá)量開始增加，隨著Ang 加入濃度的提高，成纖維細(xì)胞FN的mRNA表達(dá)也隨之增