實(shí)驗(yàn)三十三 木瓜蛋白酶性質(zhì)測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)三十三 木瓜蛋白酶性質(zhì)測(cè)定 一、目的： 1 、學(xué)習(xí)并掌握木瓜蛋白酶活性的測(cè)定基本原理。   熟練掌握不同的因素如EDTA 、半 胱 氨酸、抑制劑、 pH 等對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響原理和檢測(cè) 技術(shù)。   學(xué)習(xí)和理解酶學(xué)動(dòng)力學(xué)曲線的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)方法。 二、原理 木瓜蛋白酶（ Papain ）是一種巰基蛋白酶，它分解比胰臟蛋白水解酶更多、更廣泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量約為 23000 左右。在 25 , pH6.2 時(shí)， 1 分鐘水解 1 mol 分子苯甲酰 L 精氨酸乙脂的酶量為 1 單位。木瓜蛋白酶是單條肽鏈，有 211 氨基酸殘基折疊成兩部分形成裂縫，酶

2、分子只有 1 個(gè)巰基，對(duì)酶活力是必需的，激活劑有半胱氨酸，硫化物，亞硫酸鹽和 EDTA ；抑制劑有巰基試劑，包括重金屬和羧基試劑和過(guò)氧化氫。 酪蛋白是一種蛋白質(zhì)，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區(qū) 275nm 處有吸收峰， 根據(jù)測(cè)定 275nm 處的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小與酪氨酸含量的 多少有關(guān)，吸收值大說(shuō)明酪氨酸含量高，也就是說(shuō)木瓜蛋白酶分 解的酪蛋白多，酶活力高。 三.實(shí)驗(yàn)材料 市售木瓜蛋白酶 四.儀器設(shè)備 （ 1 ） 磁 力攪拌器（機(jī)） （ 2 ） 離心機(jī) 40001000rpm （冷凍式或非冷凍式） （ 3 ） 752 紫外分光光度計(jì) （ 4 ） 磁力攪

3、拌器 （ 5 ） 水浴箱 （ 6 ）冰箱 五.玻璃器皿（以組為單位） 試管 （ 6 ）， 100 mL 燒杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），試劑瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器 5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），濾紙（ 36 ）等 六.實(shí)驗(yàn)試劑配制及實(shí)驗(yàn)步驟 （一）酶活力測(cè)定 1 試劑 1 · 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸緩沖液， pH 7.2 配制） 2 · 0.1mol/L 的磷酸緩沖液， pH 7.2 3 ·激活劑： 3.1 用 0

4、.1mol/L 磷酸緩沖液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸， 3.2 用 0.1mol/L 磷酸緩沖液（ pH 7.2 ）配制含 8mmol/L EDTA 4 · 1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸緩沖液（ pH 7.2 ）配制 5 · 15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液 2 方法 管號(hào) 0 （對(duì)照） 1 （樣品） 2( 樣品 ) 酶液（ ml ） 0.2 0.2 0.2 激活劑（ ml ） 1.8 1.8 1.8 37 度預(yù)熱 10 分鐘 1% 酪蛋白（ ml ） 0 1.0 1.0 37 度水浴 10 分鐘 TCA （ ml ） 2.0

5、2.0 2.0 1% 酪蛋白（ ml ） 1.0 0 0 搖勻，靜置 5 分鐘過(guò)濾 OD 275nm 0.000 1.001 0.955   （二） EDTA 對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響 1 試劑 激活劑： 1 ·用 0.1mol/L 磷酸緩沖液（ PH 7.2 ）配制含 10mmol/L 半胱氨酸，分別含有 0 ， 0.2,0.4, 0.6,0.8,1,2,4mmol/L EDTA 的 8 種混合液 3 分析 三）半胱氨酸對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響 1 試劑 激活劑：用 0.1mol/L 磷酸緩沖液（ PH 7.2 ）配制含 1mmol/L EDTA, 分別含有 0 ， 1 ，

6、5 ， 10 ，20 ， 30 ， 40 ， 50mmol/L 半胱氨酸的 8 種混合液 2 方法 3 分析 （四） 抑制劑對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響 一、試劑 1 ·配制濃度分別為 0,0.5,1,2,3,4,5mmol/L 的過(guò)氧化氫溶液 2 ·用 0.1mol/L 磷酸緩沖液（ PH 7.2 ）配制濃度分別為 0.1%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1% 的 酪蛋白溶液 二、 方法 （ 1 ）不同的抑制劑（過(guò)氧化氫）濃度的抑制效果（ 4 ）不同底物濃度，無(wú)抑制劑 （五）不同 PH 值對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響 1 試劑 1 · PH 5.0 緩沖液 0.1mol/L 乙酸乙酸鈉緩沖液 PH 6.0 緩沖液 0.1mol/L 磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液 PH 7.0 緩沖液 0.1mol/L 磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液 PH 7.3 緩沖液 0.1mol/L 磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液 PH 7.7 緩沖液 0.1mol/L 磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液 PH 8.0 緩沖液 0.1mol/L 磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液 PH 9.3 緩沖液 0.1mol/L 硼砂氫氧化鈉緩沖液 PH 10.0 緩沖液 0.1mol/L 硼砂氫氧化鈉緩沖液 2 ·用以上緩沖液分別