“熱研11號”黑籽雀稗植株再生體系的建立

1、“熱研11號”黑籽雀稗植株再生體系的建立第29卷第2期2008年4月熱帶作物CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPSApr.2008熱研11號黑籽雀稗植株再生體系的建立侯海軍.郭建春胡新文1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所海1:35711012中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所長沙4101253海南大學衣學院海南儋州571737摘要以熱帶牧草熱研11號黑籽雀稗(PaspalumatratumCV.ReyanNo.11)種子為材料,對其外植體植株的再生過程進行系統(tǒng)研究.結果表明,以MS無機鹽+9.0mg/L維生素Bl+9.5mg/L維生素B+4.5mg/L尼克酸+1.0mg/L

2、水解酪蛋白+30.0g/L蔗糖+8.0g/L瓊脂為基本成分(MSM),附加植物激素類物質2.0mg/L2,4一D時,適合種子的愈傷組織形成,愈傷誘導率可達65%;繼代培養(yǎng)基附加1.0mg/L2,4一D和0.1mg/LKT;分化的培養(yǎng)基附加6.0mg/L6-BA,分化率可達50%;生根培養(yǎng)基附加0.5mg/L激素類物質NAA,生根率100%.完成植株再生約需13周.關鍵詞黑籽雀稗組織培養(yǎng)植株再生中圖分類號$544.903.53黑籽雀稗品種熱研11號(PaspalumatratumCV.ReyanNo.11)屬禾本科雀稗屬,是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院于1994年從印度印西亞引進的熱帶牧草,適宜在濕熱地區(qū)

3、中等肥力或貧瘠土壤種植,并有一定的耐寒和耐旱性.該品種在華南熱帶地區(qū)推廣種植,并己取得了巨大的經(jīng)濟和社會效益.黑籽雀稗的組織培養(yǎng)和植株再生相關研究報道極少.Can曾以雀稗(PaspalumdilatatumPoir.)幼穗誘導愈傷組織和植株再生,筆者曾以簡報形成報道熱研11號黑籽雀稗的組織培養(yǎng)和植株再生l2】,本文詳細報道該研究的結果,以便利用基因工程方法對黑籽雀稗進行品質改良,進一步提高它對環(huán)境的適應性,有利于黑籽雀稗在我國推廣種植.l材料與方法1.1試驗材料供試材料:熱研11號黑籽雀稗種子,中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院品質資源研究所提供.1.2方法1.2.1種子發(fā)芽實驗選取150粒飽滿的黑籽雀稗種子

4、,55溫水浸種1h,放置在有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,每皿50粒種子,在培養(yǎng)溫度為25下,避光使其發(fā)芽,2周后統(tǒng)計出芽率.1.2.2黑籽雀稗種子消毒首先,將黑籽雀稗種子以55溫水浸種1h,去除浮在上層的不飽滿種子,選取成熟飽滿的種子,然后用體積分數(shù)70%的酒精先消毒2min,再用0.1%0.2%(:)的氯化汞消毒35min,無菌水沖洗5次,每次45min.1.2.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件用于愈傷誘導和保持以及分化的基本培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)(MSM)31,其基本成分是MS無機鹽+維生素B,9.0mg/L+維生素B9.5mg/L+尼克酸4.5mg/L+水解酪蛋白1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8.0g/

5、L.實驗中所有的培養(yǎng)基都在滅菌前將pH調(diào)到5.8,滅菌條件為121保持20rain.經(jīng)過消毒的黑籽雀稗種子接種到誘導愈傷組織培養(yǎng)基中,置于黑暗處,在25環(huán)境下培養(yǎng).每處理接種30粒,設置3個重復.待愈傷組織長到米粒大小時,將其剝離,轉到繼代培養(yǎng)基上教育部重點資助項目(編號:204158).人事部留學人員科技行動項目.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院基金Rky0526.侯海軍男,1980年生,助理研究員.研究方向:植物基因工程.郭建春,通訊作者,E-mail:jianchunguoh163.tom收稿日期:20070611修回日期:20071010中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶牧草研究中心編.熱帶牧草及草坪草優(yōu)良品種

6、簡介G.儋州:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶牧草研究中心,2002.192期一一堡塑蘭量!:墊塑蘭:墨塹墊要竺堡墨壟蘭一.-_-_I_-_-_I-_-_I-_-_-_I-_-_I_-_I_I_I-_-_-_-_-_-一一培養(yǎng).30d后,統(tǒng)計愈傷組織誘導率并記錄愈傷生長狀態(tài).愈傷組織長到半粒黃豆大小時,進行分化培養(yǎng),每處理接種20塊愈傷組織,設置3個重復.30d后統(tǒng)計有芽分化的愈傷組織比例.叢生芽長到1cm長時,進行生根培養(yǎng),每處理接種10棵綠芽,14d后統(tǒng)計正常成苗植株的生根率.愈傷繼代時開始光照,培養(yǎng)物表面光照強度約3000lux,光照周期為16h/d.1.3公式計算及數(shù)據(jù)處理種子發(fā)芽率:發(fā)芽的種子

7、數(shù)/播種的種子數(shù)X100%愈傷誘導率:愈傷形成的種子數(shù)/接種種子總數(shù)X100%愈傷分化率:有芽形成的愈傷組織數(shù)/接種的總愈傷組織數(shù)X100%根誘導率:有根形成的芽叢數(shù)/接種的芽叢數(shù)X100%數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計分析軟件處理,鄧肯測驗.2結果與分析2.1黑籽雀稗種子發(fā)芽和愈傷組織誘導黑籽雀稗種子經(jīng)過浸種后,置于濕潤的濾紙上1周后即可陸續(xù)發(fā)芽,2周后芽長可達34cm.黑籽雀稗發(fā)芽率不高,大概在60%左右.在愈傷組織誘導的各處理激素配比下,黑籽雀稗種子發(fā)芽率都有所提高,這可能與激素能導致種子生活力提高有關.當2,4一D濃度小于2.0mg/L時,黑籽雀稗愈傷組織的誘導率隨著2,4一D濃度升高而升高,愈傷

8、狀態(tài)也越來越好,伴隨生長的芽隨著2,4一D濃度升高而變短,這是因為2,4一D改變了成熟胚的生長狀態(tài),使成熟胚脫分化.當2,4一D濃度大于2.0mg/L時,愈傷組織誘導率降低(見表1).2,4D濃度為2.0mg/L時,愈傷誘導率極顯著高于其他濃度誘導率,所以本實驗中確定MSM+2.0mg/L2,4一D+3%蔗糖+8.0g/L瓊脂為黑籽雀稗愈傷組織誘導培養(yǎng)基.2.2愈傷組織分化當6一BA濃度小于6.0mg/L時,黑籽雀稗愈傷組織的分化率隨著6一BA濃度升高而升高,愈傷褐化數(shù)量減少,每顆愈傷組織上叢生芽的數(shù)量增多.當6一BA濃度大于6.0mg/L時,分化率下降.6-BA濃度為6.0mg/L時的分化率

9、與其他濃度分化率之間存在極顯著差異,6-BA濃度為6.0mg/L時的分化率高于其他濃度(見表2).本實驗中確定MSM+6.0mg/L6一BA+3%蔗糖+8.0gm瓊脂為黑籽雀稗愈傷組織分化培養(yǎng)基.2.3植株的生根表12,4一D對黑籽雀稗愈傷組織誘導的影響說明:小寫字母不同表示在a=0.05水平上差異顯著,相同表示差異不顯著,大寫字母不同表示在a=001水平上差異顯著,相同表示差異不顯著,下同.表26-BA對黑籽雀稗愈傷組織分化的影響將分化出的叢生芽從分化培養(yǎng)基上移入含不同濃度NAA的MSM培養(yǎng)基上.在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后發(fā)現(xiàn)有的小苗開始發(fā)根,同時有部分芽沒有完成生根而逐漸枯萎死亡.當NAA濃

10、度為0.5mg/L時,叢生芽生根率為100%(見表3).本實驗中確定MSM+O.5mg/LNAA+3%蔗糖+8.0gm瓊脂為黑籽雀稗生根培養(yǎng)基.204熱帶作物29卷3討論植物組織培養(yǎng)過程中,外植體的消毒是關鍵的一環(huán).目前,比較常用的消毒方式有3種,一是體積分數(shù)70%的酒精,二是次氯酸鈉溶液,三是質量分數(shù)0.1%0.2%的升汞溶液.黑籽雀稗種子穎殼內(nèi)有大量的真菌,且黑籽雀稗種子堅硬,消毒液不易滲入,筆者采用0.2%的升汞溶液消毒35min.盡管升汞溶液濃度到0.2%,處理時間達到35min,仍然有少數(shù)種子在培養(yǎng)一段時間后長菌.表3NAA對黑籽雀稗分化綠苗生根的影響利用成熟胚為外植體誘導愈傷,成熟

11、胚的質量非常關鍵,選用當年收獲的新鮮種子,能提高愈傷誘導率.誘導植物愈傷組織常用的生長素是2,4一D和NAA.在禾本植物中2,4一D被廣泛應用,實踐證明2,4一D能高效誘導禾本科牧草愈傷形成.但是2,4一D濃度過大,將不利于愈傷生長,愈傷質量變差,出現(xiàn)很多毛狀根的現(xiàn)象,本實驗結果也很好的重復了前人的經(jīng)驗.愈傷繼代培養(yǎng)時,采取降低2,4一D的濃度到1.0mg/L同時加入0.1mg/L細胞分裂素KT使黑籽雀稗愈傷組織快速增殖和形成體細胞胚,這為分化奠定了良好的基礎.細胞分裂素類物質6一BA被廣泛應用于禾本科植物愈傷組織分化,但是不同的植物所需6-BA濃度不一.本實驗中確定的黑籽雀稗愈傷組織分化最適

12、宜6-BA濃度為6.0mg/L.,筆者摸索出了一套再生頻率較高的黑籽雀稗組織培養(yǎng)方法,所誘導的愈傷組織可作為轉基因研究的受體材料.這為下一步基因工程操作(基因槍法和根癌農(nóng)桿菌法),將外源優(yōu)質基因導人黑籽雀稗,從而獲得轉化植株,以及開展黑籽雀稗體細胞無性系變異利用,突變體篩選以及基因轉移等方面的研究工作奠定了良好基礎.A:在誘導培養(yǎng)基上愈傷組織的生長狀態(tài);B,C,D:在分化培養(yǎng)基上芽的生長狀態(tài);E:綠芽在生根培養(yǎng)基上生根狀態(tài);F:移栽苗在苗圃中的生長狀態(tài)圖1黑籽雀稗植株再生過程2期侯海軍等:熱研11號黑籽雀稗植株再生體系的建立205參考文獻1CanE.AdiYalancydary(Paspalu

13、mditalatumPoir.)bitrisiningencsalkymlaryndaukallusolusumuvebitkrejenerasyonunagenotipve2,4一DkonsantrasyonunumetkileriuzerindebirarastyrmaJ1.TurkJAgrFor,1998,24(1):1131192侯海軍,胡新文,段瑞軍,等.黑籽雀稗品種熱研11號的組織培養(yǎng)與植株再生Jl植物生理學通訊,2006,42(3):4833張萬軍,王濤.多年生黑麥草組織培養(yǎng)與植株再生研究J.草地,2003,11(3):2192224張萬軍,李天紅,王濤,等.高羊茅高頻植株再生體

14、系的建立及其影響因子的分析J.農(nóng)業(yè)生物技術,2004,12(2):1571615曲同寶,王丕武,關淑艷,等.羊草組織培養(yǎng)及再生系統(tǒng)的建立fJ.草業(yè),2004,l3(5):91946徐子勤,陳利紅.蕎麥組織培養(yǎng)及高頻植株再生體系的建立【J.分子細胞生物,2006,3(5):4454517王淑芬,李雪,簡麗觀.藍羊茅的組織培養(yǎng)與植株再生J.植物生理學通訊,2006,2(1):67TissuecultureandPlantRegenerationofTropicalPasturePaspalumatratumHouHaijunGuoJianchunHuXinwen1InstituteofSubtro

15、picalAgriculture,ChineseAcademyofSciencesChangsha410125China2CollegeofAgronomy,SCUTADanzhouHainan571737China3InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciencesHaikouHainan571101ChinaAbstractAsystematicstudyofplantregenerationoftropicalpasturePaspalumatratumhas

16、beenconducted.TheresultshowedmodifiedMSmedium(MSM)composedofMSsah+9.0mg/LvitaminBl+9.5mg/LvitaminB6+4.5mg/Lnicotinicacid+1.0mg/Lcaseinhydrolisate+30g/Lsucrose+8g/LagarasbasicmediumwassuitableforinducingcallusformationfromPaspalumatratumseedswhen2.0mg/L2,4一Dwasadded.andgaveafrequencyofcallusinductionof65%.Thesubculturemediumwasaddedwith1.0mg/L2,4一Dand0.1mg/LKT.TheMSMfordifferentiationatthepr