他克莫司軟膏對(duì)特應(yīng)性皮炎皮損角質(zhì)形成細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的影響

1、他克莫司軟膏對(duì)特應(yīng)性皮炎皮損角質(zhì)形成細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的影響?420?北京大學(xué)(醫(yī)學(xué)版)JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)Vo1.38No.4Aug.2006?論著?他克莫司軟膏對(duì)特應(yīng)性皮炎皮損角質(zhì)形成細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的影響謝志強(qiáng).,劉玲玲.,揚(yáng)高云,朱學(xué)駿(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科,北京100034;2.清華大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科)摘要目的:探討Toll樣受體(Tolllikereceptor,rI'LR)2和rI'LR4在特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis,AD)發(fā)病機(jī)制中的意義及外用他克莫司

2、軟膏(商品名,普特彼)對(duì)TLR2和TLR4表達(dá)的影響.方法:采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)9例中至重度AD患者急性發(fā)作期炎性皮損與正常對(duì)照皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá),以及外用他克莫司軟膏單一療法治療AD3周后rI'LR2和rI'LR4表達(dá)的變化.結(jié)果:免疫組化檢測(cè)顯示在正常皮膚基底層角質(zhì)形成細(xì)胞胞膜散在表達(dá)TLR2和TLR4.TLR2和TLR4在AD急性發(fā)作期炎性皮損角質(zhì)形成細(xì)胞胞膜及胞漿過(guò)度表達(dá),以細(xì)胞膜表達(dá)為主,主要定位于基底層至顆粒層;他克莫司治療3周后改善特應(yīng)性皮炎皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2和TLR4表達(dá),主要定位于基底或基底上層角質(zhì)形成細(xì)胞膜.結(jié)論:正常角質(zhì)形成

3、細(xì)胞表達(dá)的TLR2和TLR4是構(gòu)成皮膚天然免疫系統(tǒng)的組成部分.AD角質(zhì)形成細(xì)胞誘導(dǎo)性過(guò)度表達(dá)TLR2和TLR4與AD皮膚天然免疫炎癥反應(yīng)有關(guān),外用他克莫司可通過(guò)直接或間接作用抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2和TLR4誘導(dǎo)性表達(dá),從而抑制與TLR一細(xì)胞核因子KB(NFKB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控途徑有關(guān)的AD皮膚天然免疫炎癥反應(yīng).關(guān)鍵詞皮炎,特應(yīng)性;他羅利姆;受體,細(xì)胞表面中圖分類號(hào)R758.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1671167X(2006)04-0420-04EffectoftopicaltacrolimusointmentonexpressionofToll-likereceptors2and4inle

4、sionalatopicdermatitisskinXIEZhiqiang,LIULingling,YANGGaoyun,ZHUXue-jun.(1.DepartmentofDermatology,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China;2.DepartmentofDermatology,TsinghanUniversityFirstHospita1)ABSTRACTObjective:ToinvestgatetheroleofT0lllikereceptor(TLR)2andTLR4inpathogenesisofatopicder

5、matitis(AD)andtheeffectoftopicaltacrolimusointmentonexpressionofTLR2andTLR4inlesionalADskin.Methods:ImmunohistochemistrywasemployedtostudytheexpressionofTLR2andTLR4innornlalskinandlesionalADskinbeforeandafterusingtopicaltacrolimusointment.Resuits:Thebasalkeratinocytesinnormalskinconstitutivelyexpres

6、sedTLR2andTLR4.Incontrast,lesionalep.idermisfrom9patientswithacuteADoverexpressedTLR2andTLR4onthewholeepidermiskeratino.cyteswithmembranousandcytoplasmicstainingpattern.Atierusingtopicaltacrolimusointmentforthreeweeks.TLR2andTLR4wereexpressedonbasalandsuprabasalkeratinocyteswithmembranousandcyto.pla

7、smicstainingpattern.Conclusion:ThesedatasuggestthatTLR2andTLR4expressedbyepidermalkeratinocytesconstitutepartoftheinnateimmunesystemoftheskin.andincreasedTLR2andTLR4ex.pressionmayberelatedtotheskininnateimmuno.inflammatoryresponseinatopicdermatitis.Topicalta.crolimusmaydirectlyorindirectlyinhibitord

8、ownregulateTLR2andTLR4expressioninKCandinhibitskininnateimmuno.inflammatoryresponserelatedtoTLR.NFKBsignaltransductionandregulationinatopicdermatitis.KEYWORIDSDermatitis,atopic:Tacrolimus;Receptors,cellsurface特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis,AD)是一組具有遺傳傾向的,與特應(yīng)性有關(guān)的并且伴有表皮異常性改變的濕疹樣皮膚病¨.基礎(chǔ)研究顯示除T細(xì)胞及其介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)外

9、,角質(zhì)形成細(xì)胞也是參與AD發(fā)病機(jī)制的重要細(xì)胞¨.角質(zhì)形成細(xì)胞可在各種刺激下活化并產(chǎn)生多種生物活性分子.近年發(fā)基金項(xiàng)目:教育部教育振興行動(dòng)計(jì)劃特殊專項(xiàng)("九八五"工程)資助SupposedbySpecialFundforPromotionofEducation,MinistryofEducationP.R.CCorrespondingauthor'Semail.zhuxj.ca謝志強(qiáng),等他克莫司軟膏對(duì)特應(yīng)性皮炎皮損角質(zhì)形成細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的影響現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞可以表達(dá)與天然免疫有關(guān)的Toll樣受體(Tolllikereceptor,TLR)和防御素

10、J,表明位于環(huán)境界面的角質(zhì)形成細(xì)胞不但是構(gòu)成表皮的結(jié)構(gòu)細(xì)胞,而且還是參與皮膚天然免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞.他克莫司軟膏(商品名,普特彼)是一種新型外用免疫調(diào)節(jié)劑.外用他克莫司可抑制AD皮膚炎癥反應(yīng).最初的研究證明其作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制鈣調(diào)磷酸酶而抑制激活性T細(xì)胞的細(xì)胞核因子(nuclearfactorofactivatedTceHs,NFAT)的轉(zhuǎn)錄,繼而抑制T細(xì)胞的活化及其介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)J.近年研究發(fā)現(xiàn)他克莫司還可以通過(guò)作用于天然免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞,肥大細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞)而起作用J.我們以前的研究證實(shí)外用他克莫司可抑制AD皮損角質(zhì)形成細(xì)胞胞核因子KB(nuclearfactorKB

11、,NFKB)核表達(dá).TLR2和TLR4是與角質(zhì)形成細(xì)胞的NFKB活化有關(guān)的重要信號(hào)受體.因此,我們觀察外用他克莫司軟膏對(duì)特應(yīng)性皮炎角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2和TLR4表達(dá)的影響并探討其意義.1對(duì)象與方法1.1對(duì)象選擇9例中至重度急性發(fā)作期AD患者,診斷符合Williams標(biāo)準(zhǔn)及Rajka等JAD嚴(yán)重程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn).所有患者1周前未外用過(guò)皮質(zhì)類固醇激素,4周前未系統(tǒng)接受過(guò)皮質(zhì)類固醇激素,免疫抑制劑及光化學(xué)治療.9例患者臨床特征見(jiàn)表1.表1特應(yīng)性皮炎患者特征CharacteristicofpatientswithatopicdermatitisPatientsAge(year)SexLesionArea

12、(%)IgE(IU/mL)33467l58.83888ll863593l6388370Eosinophil(%)Eczemaseverity1.2用藥方法在AD皮炎部位外涂一薄層0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),成人)或0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),兒童)他可莫司(商品名:普特彼)軟膏,每日2次,用藥間隔1014h,療程3周.研究對(duì)象(AD患者)均簽署知情同意書.本實(shí)驗(yàn)獲得北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2003臨審第42號(hào))及國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批文許可(批號(hào)2003L01257).1.3臨床療效觀察指標(biāo)采用濕疹面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(eczemaareaandseverityindex,EASI)作為I臨床療效

13、評(píng)估指標(biāo).1.4免疫組織化學(xué)選擇并切取4例正常人皮膚(取自整形手術(shù)正常皮膚)及9例AD患者急性發(fā)作期皮損與治療后同部位皮膚標(biāo)本,包埋于最適切片溫度復(fù)合物中,液氮速凍后移至一80冰箱保存用于冰凍切片.TLR2羊多克隆抗體和TLR4鼠單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)SantaCruzBiotechnology公司.鏈霉卵白素一過(guò)氧化物酶(streptavidinHRP,SP)免疫組化染色試劑盒購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司.實(shí)驗(yàn)步驟按SP一9003Histostain一PlusKits產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作.實(shí)驗(yàn)操作步驟如下:新鮮皮損包埋于最適切片溫度復(fù)合物中,于液氮或一80冰箱保存.標(biāo)本于冰凍切片機(jī)切片6m厚.4丙酮

14、固定10min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗,5min×3.用3%(體積分?jǐn)?shù))過(guò)氧化氫孵育10min,消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性.PBS洗,5min×3.用于TLR2檢測(cè)的冰凍切片于10%(體積分?jǐn)?shù))正常兔血清封閉(即室溫孵育)10min,用于TLR4檢測(cè)的冰凍切片于10%(體積分?jǐn)?shù))正常羊血清封閉(即室溫孵育)10min,勿洗.滴加稀釋一抗,4過(guò)夜.陰性對(duì)照:一抗為PBS.PBS洗,5min×3.滴加生物素標(biāo)記二抗,37溫孵育20min.PBS洗,5min×3.滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素,37溫孵育20min.PBS洗,5min×3.DAB顯色.自

15、來(lái)水充分沖洗,復(fù)染,封片.1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn).采用SPSS11.058779868773669354436l7O52677mm一一;.加弘eeeeekknnnnaaanamm弘¨window,統(tǒng)仆軟件包完成2結(jié)果Ej凡'報(bào)撕If'LI/LIlrPI'KINI;LN1,:ISIr,一IIIH_lEI:ES-,?l38-4u20062.1AI)忠者皮膚辱障缺所收集9刪1)心者中8例患暫皮膚行,上不同性度十皮f88.9%.8,/9).!】皮膚屏障缺陷,提示住此組患者r¨j致病Nf-經(jīng)_點(diǎn)從接觸劃激nr能是其弧要的炎癥觸發(fā)途徑22他l其

16、司;向療引AD的ICES影l(fā)向外尉0.1%或003%他川'葜司治療3J割后的EASI假(5.3【-I-6.83)薔低丁治療前的EASI幢(3830±1686.P<OO1).口JJff療后皮損著改善2.3D發(fā)孔ltgI莉川特征瘸州政變符合急或韭急陛朗皮炎改變.r表皮增牛,什海綿H水.皮淺層單一核細(xì)胞浸潤(rùn)外¨j他兜莫司軟膏治療3J甜后AI】常規(guī)病衄改變?yōu)樵雠５谋砥ぷ儽?海綿水淌失.單?骸細(xì)胞浸潤(rùn)疆著減少24AD皮損與止常皮膚角質(zhì)形成細(xì)1施rLR2表達(dá)及定協(xié)特征免疫組化檢測(cè)娃示:常對(duì)照皮膚,.¨.2表達(dá)于基底層角質(zhì)形成圳胞胞漿受胞聰.以胞漿為主f割

17、lA);:A1)急性發(fā)作芷損,'JI2過(guò)度辰迓于墊底層至顆粒層侑質(zhì)形成細(xì)胞胞膜及胞漿.胞幞為主(IB):外川他克莫司軾膏淆療3周后.R2主要文達(dá)下越底層盟基底【.J伯質(zhì)1成fill!咆漿及胞膜,顆粒層搜棘細(xì)胞上喪選消失或散芷發(fā)達(dá)(1割】c)25AD皮_f=!與JE常皮膚舶質(zhì)肜成胞lI.R4表達(dá)及定位特征免疫化榆測(cè)顯;:莊II常x,J照皮膚,¨.R4表達(dá)于基底層角質(zhì)形成細(xì)胞胞脫(圈);在AI)急發(fā)作期皮損,'l'lR4過(guò)虞占基底J至擷粒層角質(zhì)形成細(xì)胞咆膜(1E):外用他妃其軟膏治療3心后,11R4主要轟叢于基底層坎基底上層侑質(zhì)J成I胞胞膜,¨.R4顆粒

18、層硬細(xì)1弛【_層轟達(dá)消失或敞在發(fā)達(dá)(lF1一一.klrIlJ1?yl'l1f2lJ¨innomalk】¨lSI'×200?¨.kral【l¨,lI'1.1!?'fn-L.¨Ibe一I-llIln1SI',×21x).:(.k?+rH1Illx'hI'IR2n'l:-rtr?i111ISIx2(10.I)lk,mtlin,;wleT】t4olinn,rmal,SP.x!x:;kentliyl?IIR4叫.fI,efimI,al-¨¨2(1I.k

19、,-ratiB+I'LR4?n,rdnx!州圖1特r性靶r曲喪T甬壓肜成細(xì)抱I【ll2和1LR4擊一土免蹙皇ll化坫44I,'igrelllllUlII)IHining''I兀RandPLR4inkeratin,c)IlJ(1F【llADkbelimd州imrrh-;ihn-¨ITLR足一r,f【圳微生物組分千u細(xì)胞成分的模式識(shí)別受體,通過(guò)'ll別其配.|=激活MyD88一FKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介天然免疫應(yīng)答及炎癥反近年研究fili實(shí)角質(zhì)J成細(xì)胞喪叢多種n1(如r1.R2和TllP;4)TII2體包括外源性配體(如金葡萄球菌的成份肽策特,真蕭的f露

20、壤糖)硬內(nèi)源體(如熱休克籃70)rLi4體包括外源性體(如月多糖)和源性體(如HSP60).這些配體可通過(guò)TlR激活I(lǐng)?D88一NrKI信轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.儆活NFK刪控的,與免崆和炎反有關(guān)的多種靶基因,參多種免疫炎癥性疾癇的發(fā)病機(jī)制J此.R已成為對(duì)炎癥性疾墑具_(dá)仃滿在清療意義的謝志強(qiáng),等他克莫司軟膏對(duì)特應(yīng)性皮炎皮損角質(zhì)形成細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的影響靶受體J.本研究發(fā)現(xiàn)外用他克莫司在抑制AD皮膚炎癥反應(yīng)的同時(shí)可抑制或下調(diào)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2和TLR4誘導(dǎo)性過(guò)度表達(dá).以前的研究發(fā)現(xiàn)AD患者皮膚對(duì)多種病原體特別是金葡萄球菌易感性增加¨,金葡萄球菌可導(dǎo)致AD皮炎發(fā)生或加重.新近研究證

21、實(shí)金葡萄球菌的成份肽聚糖可通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2受體信號(hào)途徑激活NFKB12J并促進(jìn)IL一8及其他促炎細(xì)胞因子(如IL一1,IL-6,TNFot基因)表達(dá).TLR4是LPS的受體,正常角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)CD14一TLR4復(fù)合體,LPS可通過(guò)TLR4激活角質(zhì)形成細(xì)胞的NFKB并促使角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL一1和IL一8¨.本研究發(fā)現(xiàn)AD表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的TLR2和TLR4則為其配體通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR激活NFKB提供了條件.因此,TLR2和TLR4雖然接受不同的特異性配體,但在介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞活化上具有協(xié)同作用.由TLR途徑激活角質(zhì)形成細(xì)胞的NFKB所釋放的促炎細(xì)胞因子(如I

22、L一8,IL一1,IL-6,TNFot)直接參與或啟動(dòng)皮膚的天然免疫應(yīng)答及伴發(fā)的炎癥反應(yīng).由于這種炎癥反應(yīng)是細(xì)菌成分或類感染因子啟動(dòng)的炎癥反應(yīng),并且主要是TLR依賴的表皮炎癥反應(yīng),因此可視為是一種皮膚天然免疫炎癥反應(yīng),推測(cè)這一反應(yīng)直接參與了AD免疫發(fā)病機(jī)制.此外,TLR2和TLR4還識(shí)別組織細(xì)胞損傷釋放的內(nèi)源性配體(如HSPT0)和透明質(zhì)酸分解產(chǎn)物等¨,并由此激活NFKB.因此,通過(guò)下調(diào)AD急性發(fā)作期皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2和TLR4過(guò)度表達(dá),外用他克莫司不但可下調(diào)由外源性配體通過(guò)TLRNFKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的皮膚天然免疫炎癥反應(yīng),而且還可能下調(diào)由內(nèi)源性配體通過(guò)TLRNFKB信號(hào)

23、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的皮膚天然自身免疫炎癥反應(yīng).他克莫司可上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞的TGFB¨,而TGFB可抑制TLR表達(dá)_1,支持他克莫司可能通過(guò)間接機(jī)制調(diào)節(jié)TLR表達(dá).有趣的是本研究結(jié)果顯示外用他克莫司可抑制基底層以上的角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2和TLR4誘導(dǎo)性過(guò)度表達(dá),并不抑制基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR2和TLR4組成性表達(dá),提示外用他克莫司3周可能并不影響TLR2和TLR4在基底層角質(zhì)形成細(xì)胞上介導(dǎo)的天然免疫功能,但長(zhǎng)期應(yīng)用的影響有待于進(jìn)一步觀察.因此,本研究結(jié)果提示AD免疫發(fā)病機(jī)制涉及由TLRNFKB介導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞參與的表皮天然免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制,他克莫司可通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的TLR誘導(dǎo)性

24、過(guò)度表達(dá)而下調(diào)由TLRNFKB介導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞參與的皮膚天然免疫炎癥反應(yīng).參考文獻(xiàn)1LeungDYM,BoguniewiczM,HowellMD,eta1.NewinsightsintoatopicdermatitisJ.JClinInvest,2004,113:651657.2KoilischG,KalaliBN,VoelckerV,eta1.VariousmembersoftheTolllikereceptorfamilycontributetotheinnateimmuneresponseofhumanepidermalkeratincytesJ.Immulogy,2005,114:5

25、31541.3BraffMH,BardanA,NizetV,eta1.CutaneousdefensemechanismsbyantimicrobialpaptidesJ.JInvestDermatol,2005,125:913.4NovakN,KwiekB,BieberT.ThemodeoftopicalimmunomodulatorsintheimmunologicalnetworkofatopicdermatitisJ.ExpDermatol,2005,30:160164.5謝志強(qiáng),劉玲玲,竇俠,等.特應(yīng)性皮炎皮損角質(zhì)形成細(xì)胞NFKB表達(dá)及外用他克莫司對(duì)其影響J.北京大學(xué)(醫(yī)學(xué)版),20

26、04,36:4874906WilliamsHC,BurneyPG,HayRD,eta1.TheU.K.workingpar-tysdiagnosticcriteriaforatopicdermatitis.1.DerivationofaminimumsetofdiscriminatorsforatopicdermatitisJ.BrJDermatol,1994,131:383396.7RajkaG,LangelendT.GradingoftheseverityofatopicdermatitisJ.ActaDermVenereolSuppl(stockh),1989,144:1314.8Tak

27、edaK,KaishoT,AkiraS.ToilLikeReceptorsJ.AnnuRevImmunol,2003,21:335376.9OneiilLAJ.TherapeutictargetingofTolllikereceptorsforinflammatoryandinfectiousdiseasesJ.CurrOpinPharmacol,2003,3:396403.1OOngPY,OhtakeT,BrandtC,eta1.EndogenousantimicrobialpeptidesandskininfectionsinatopicdermatitisJ.NEnslJMed,2002,347:11511157.11BreuerK.KappA.WerfelT.Bacteralinfectionsandatopicder-matitisJ.Allergy,2001,56:10341041.12MempelM,VoelckerV,KoIlischG.eta1.Toilli