實時熒光定量PCR [兼容模式]

1、實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR的原理和應(yīng)用PCR(Polymerase Chain Reaction : 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù), 能將微量的能將微量的DNA DNA DNA大量復(fù)制大量復(fù)制。 94 PCR分四個階段 qPCR 技術(shù):qPCR技術(shù)是在PCR實驗方法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的技術(shù),能夠?qū)CR擴(kuò)增的目標(biāo)DNA進(jìn)行定量分析。具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)普通PCR技術(shù):擴(kuò)增目標(biāo)DNA量,對目標(biāo)DNA片段做定性分析,但無法準(zhǔn)確得知目標(biāo)DNA的含量優(yōu)點(diǎn):實時監(jiān)

2、測、不需電泳、精確定量等qPCR 在PCR 的基礎(chǔ)上加入熒光染料或熒光探針,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR 反應(yīng)過程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。SYBR green 一、qPCR 定義定義、原理和常用熒光染料是目前最常用的熒光染料光染料,它能夠結(jié)合雙鏈狀態(tài)的DNA 分子,一旦結(jié)合就能夠發(fā)出熒光,但未結(jié)合DNA 的游離SYBR green 沒有任何熒光。SYBR green 熒光強(qiáng)度反映了當(dāng)前樣品中的DNA 濃度 實時熒光擴(kuò)增曲線圖 在指數(shù)增長期檢測熒光值:無法在同一時間點(diǎn)保證所有樣品都處在對數(shù)增長期閾值在指數(shù)增長期選擇一個熒光閾值,濃度高的樣品比濃度低的樣品先到達(dá)閾值為了定量

3、和比較的方便,在實時熒光定量PCR 技術(shù)中引入了幾個重要的概念:基線(Baseline:是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初基線數(shù)個循環(huán)里,熒光信號變化不大。接近一條直線,這樣的直線即是基線。熒光閾值(thresholdC T:是在熒光擴(kuò)增曲線熒光閾值上人為設(shè)定的一個值,它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,一般熒光域值的設(shè)置是基線(背景熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍。熒光域值是PCR的315個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍,熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。 閾值C T值C T值(cycle threshold:樣品熒光值到達(dá)閾值樣品熒光值到達(dá)閾值,所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)C T值越小,樣品濃度越高 E:擴(kuò)增效

4、率X0:起始DNA濃度 用已知濃度值的樣品(標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并測得CT值。由標(biāo)準(zhǔn)品的CT 值與濃度值(X可以得到方程式中的常數(shù)值 根據(jù)公式可以通過CT值計算出未知樣品的濃度。 二、Real-time PCR 方法應(yīng)用絕對定量(Absolute Quantification,AQ病原體檢測轉(zhuǎn)基因食品檢測基因表達(dá)研究相對定量(Relative Quantification,RQ基因在不同組織中的表達(dá)差異藥物療效考核耐藥性研究絕對定量與相對定量的定義 絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品:已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA,做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類:含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同

5、擴(kuò)增片段的cDNAPCR的產(chǎn)物絕對定量絕對定量:從熒光到拷貝數(shù) 相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量內(nèi)標(biāo)(Endogenous Control通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定,受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量內(nèi)標(biāo)(內(nèi)參照-校正模板在數(shù)量上的差異qPCR定量實驗是需要設(shè)定內(nèi)參照的,排除用于檢測的樣品添加量的差異。在實際操作中,很多環(huán)節(jié)導(dǎo)致用于定量實驗的樣品添加量是不一樣的。細(xì)胞都會表達(dá)一種叫做管家基因的基因,它的特點(diǎn)是,無論什么組織,什么細(xì)胞,在何種狀態(tài)下,管家基因的表達(dá)量是恒定的。選用管家基因作為內(nèi)參照,其含量正比于細(xì)胞數(shù)作為內(nèi)參

6、照,統(tǒng)計數(shù)據(jù)時根據(jù)管家基因含量較正數(shù)據(jù),就可以排除添加量的影響。常用的內(nèi)參照:GAPDH, Actin, 18S-rRNA相對定量:參照因子Calibrator 相對定量分析方法1 2-Ct前提:目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100%且偏差在5%以內(nèi)1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值:CT(test= CT (target,test -CT (ref,testCT(calibrator= CT (target, calibrator -CT (ref, calibrator 2、用校準(zhǔn)樣本的CT值歸一試驗樣本的CT值:CT= CT(test -CT(calibrator3、計算表達(dá)水

7、平比率:2 CT=表達(dá)量的比值實例對照組實驗組 相對定量分析方法2:雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同 待測樣品目的基因濃度待測樣品內(nèi)參基因濃度F=對照樣品目的基因濃度對照樣品內(nèi)參基因濃度一次qPCR實驗的分組設(shè)置對照組實驗組陽性對照已知必定能得到擴(kuò)增曲線的樣品用于判斷實驗過程是否存在問題,排除假陰性陰性對照(空白對照不添加DNA模板,其余成分齊全用于排除污染等因素導(dǎo)致的假陽性三、熒光標(biāo)記的種類非特異性熒光標(biāo)記:SYBR Green特異性熒光標(biāo)記:TaqMan,Molecular Beacon(分子信標(biāo)法,Amplisensor(復(fù)合探針法1、SYBR Green 法 SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便-不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜熔解曲線反應(yīng)結(jié)束后設(shè)定一個升溫過程,然后慢慢把溫度降下來,因為不同DNA 片段的解鏈溫度不同,這時若PCR 產(chǎn)物純,則只會出現(xiàn)一個熒光峰,若有雜質(zhì),則會出現(xiàn)其他峰值,這是一個特異性檢測方法。驗證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性,防止引物的非特異性干擾定量檢測結(jié)果。 2、TaqMan探針法 TaqMan探針的工作原理 TaqMan法優(yōu)缺