實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在水稻氮素基因表達(dá)中的應(yīng)用研究與展望

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在水稻氮素基因表達(dá)中的應(yīng)用研究與展望              作者：李榮德 董芙蓉 范祥云 徐愷 邱杰 徐揚(yáng) 黃麗芬摘要實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)低拷貝基因表達(dá)量的快速、準(zhǔn)確定量,綜述了目前水稻氮素吸收利用相關(guān)基因的研究成果,展望了熒光定量PCR技術(shù)在水稻氮素相關(guān)基因表達(dá)中的應(yīng)用前景。 關(guān)鍵詞水稻;氮素;基因表達(dá);熒光定量PCR;應(yīng)用研究;展望 20世紀(jì)6070年代水稻矮化育種和雜交稻三系配套的成功和應(yīng)用使水稻產(chǎn)量大幅度提高,但同時(shí)導(dǎo)致氮

2、肥施用量的急劇增加。盡管氮肥在提高水稻產(chǎn)量的過(guò)程中起著非常重要的作用,但對(duì)地下水、土壤、河流、湖泊和大氣等農(nóng)業(yè)環(huán)境的污染嚴(yán)重,間接影響人體健康。目前在作物生產(chǎn)中氮素利用率較低,只有28%40%1,而水稻是我國(guó)第一大糧食作物,因此如何提高水稻氮素利用率,是當(dāng)前亟需攻克的重要課題。筆者介紹熒光定量PCR技術(shù)在水稻氮素基因表達(dá)中的研究應(yīng)用,以期在基因水平上為水稻育種提供一種方法。 1水稻與氮素的關(guān)系研究 1.1氮在水稻生產(chǎn)中的作用 世界上許多地區(qū)的水稻生產(chǎn)越來(lái)越注重于優(yōu)化籽粒產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本、減少對(duì)環(huán)境的污染危害2。限制水稻生產(chǎn)的投入之一是氮,氮素對(duì)水稻是重要的,約75%的葉片氮與葉綠體有關(guān),而后

3、者通過(guò)光合作用在干物質(zhì)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的生理作用。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期水稻吸收氮素促進(jìn)生長(zhǎng)和分蘗,從而決定潛在的穗數(shù);在穗形成初期氮素有利于小穗的形成;而在穗形成后期,則通過(guò)減少退化小穗數(shù)增加谷殼大小而增加庫(kù)容。氮素在抽穗前增加了莖和葉鞘中碳水化合物的積累,而在籽粒灌漿中則有助于增加籽粒中碳水化合物的積累。 1.2水稻氮肥吸收利用率現(xiàn)狀 長(zhǎng)期以來(lái)大量施用氮肥一直是穩(wěn)定和提高水稻產(chǎn)量的重要措施,因不斷增加水稻植株中的氮素含量導(dǎo)致回報(bào)率降低,并不是總能增加水稻產(chǎn)量,因此從經(jīng)濟(jì)方面考慮這一措施并不總是最優(yōu)的。同時(shí),過(guò)量施用氮肥還會(huì)對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在的不利影響,并增加病害的發(fā)生和倒伏。水稻的種植容易導(dǎo)致

4、氨揮發(fā)、硝化-反硝化脫氮、淋溶以及徑流而使氮素丟失?；诖?國(guó)內(nèi)外越來(lái)越重視研究和改良水稻氮素吸收利用的遺傳潛力和生理機(jī)制,建立高效生產(chǎn)技術(shù)體系,從根本上提高水稻對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的吸收利用。我國(guó)的氮肥吸收利用率為30%35%,低于世界平均水平。我國(guó)與日本的水稻單產(chǎn)水平大致相當(dāng),但單位施氮的產(chǎn)谷效益不足日本的1/2。根據(jù)李榮剛報(bào)道,江蘇省水稻的氮肥吸收利用率僅為19.9%,顯著低于全國(guó)平均水平,如此低的氮肥吸收利用率主要是由于江蘇稻農(nóng)氮肥施用量過(guò)高所致。 1.3水稻氮素利用效率與高氮素利用水稻品種 提高水稻養(yǎng)分利用效率尤其是氮素利用效率的研究正在全球興起。水稻利用氮素的效率包括氮吸收效率和氮利用效率。

5、植物氮吸收量與供氮量之比為氮吸收效率;而籽粒產(chǎn)量與氮吸收之比為氮素利用效率。近些年開始強(qiáng)調(diào)氮高效水稻育種,并不是對(duì)水稻育種40余年所取得的育種成果的否定,而是在節(jié)約資源和保護(hù)環(huán)境背景下對(duì)水稻育種工作提出的新的要求;并不是一味追求氮素利用效率而犧牲對(duì)高產(chǎn)要求,而是較高的產(chǎn)量水平下的高氮素利用效率。在現(xiàn)有的推廣品種中就存在產(chǎn)量高、氮素利用效率高的“雙高”基因型的品種。 2水稻氮素吸收利用的相關(guān)基因 植物氮素營(yíng)養(yǎng)作用是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,氮效率的遺傳力、控制基因的數(shù)目、基因間的相互作用等問(wèn)題仍不十分明確,如何選擇氮素高效率基因型一直是研究者們探索的重點(diǎn)。近年來(lái),分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,為作物遺傳與育種

6、工作提供了新的手段。迄今,在分子水平上對(duì)不同形式的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及氮代謝相關(guān)酶類的研究有了很大的進(jìn)展3。許多有關(guān)氮代謝酶基因被鑒定和克隆,為用生物工程的方法提高氮效率提供了有效的途徑。 2.1氮素吸收相關(guān)基因 雖然高等植物可以利用有機(jī)態(tài)的氮,但根系主要吸收的氮源還是NO3- 和NH4+。近年來(lái),人們從分子水平上對(duì)硝態(tài)氮的吸收系統(tǒng)進(jìn)行了大量研究。已發(fā)現(xiàn)2 種基因NRT1 和NRT2 與硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(HATS 和LATS)有關(guān)。目前已從多種作物中克隆了硝態(tài)氮低親和系統(tǒng)的基因。越來(lái)越多的證據(jù)表明,銨高親和轉(zhuǎn)運(yùn)體應(yīng)是AMT1 家族的成員,原因是AMT 蛋白在植物根系吸收土壤氮素中起主要作用。如在擬南芥

7、根系中,AtAMT1;1、AtAMT1;2和AtAMT1;3 基因都有充分的表達(dá),而且通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因,改變了根系對(duì)銨的吸收活力。植物中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的AMT1 基因是擬南芥中的AtAMT1;3,用核DNA 消減法也從酵母銨運(yùn)轉(zhuǎn)體缺陷型突變體中克隆了此基因。AtAMT2基因在擬南芥的所有器官中都有表達(dá),受氮素的調(diào)節(jié),在根系的表達(dá)部分受到高濃度硝酸銨的抑制。在地上部分,AtAMT2的表達(dá)基本不受根部氮素狀態(tài)的調(diào)節(jié);所以在植物體的所有細(xì)胞中,AtAMT2在銨從質(zhì)外體到共質(zhì)體的運(yùn)輸中可能有重要作用。 2.2氮素利用基因 谷氨酰胺合成酶GS是參與植物氮代謝的關(guān)鍵酶。高等植物中編碼GS的基因的表達(dá)是一個(gè)十

8、分復(fù)雜的過(guò)程,而且因植物種屬的不同而呈差異表達(dá)。植物發(fā)育進(jìn)程以及光照、氮源的形式、水分、NaCl等外界因子均影響GS基因的表達(dá)。作物在吸收氮素的過(guò)程中具備1套酶系統(tǒng),能有效地將氨轉(zhuǎn)化為氨基酸,進(jìn)而同化為蛋白質(zhì)。氨基酸的合成是通過(guò)GS和谷氨酸合成酶(GOGAT)的偶聯(lián)作用,同時(shí)有各種氨基轉(zhuǎn)移酶參加完成。GS、GOGAT 在植物葉片、根瘤以及根中均有分布3,但在不同器官中GS/ GOGAT 循環(huán)的作用不盡相同。在綠色組織中,GS/ GOGAT 循環(huán)的主要作用是同化光呼吸產(chǎn)生的NH4+ 以及硝酸鹽在葉中還原產(chǎn)生的NH4+,在根瘤中則主要同化根瘤菌固氮 產(chǎn)生的NH4+,而在根中則是同化吸收到體內(nèi)的NH

9、4+ 以及硝酸鹽被吸收后在根中還原產(chǎn)生的NH4+。高等植物體內(nèi)95%以上的NH4+通過(guò)GS/ GOGAT循環(huán)同化合成氨基酸,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)所吸收的氮素的利用。 綜上所述,在目前已知的氮素吸收系統(tǒng)相關(guān)基因主要有4類:銨吸收基因AMT、硝吸收基因NRT、GS基因和GO GAT基因。 3熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用 3.1熒光定量PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn) 傳統(tǒng)PCR 可對(duì)特定核苷酸片段進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后,可以通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析,也可以通過(guò)對(duì)光密度掃描來(lái)進(jìn)行半定量分析。但是無(wú)論定性還是半定量分析,分析的都是PCR 終產(chǎn)物,不能確保PCR 產(chǎn)物信號(hào)與初始模板的拷貝數(shù)成比例。由于吸收

10、基因表達(dá)量很低,很難進(jìn)行精確定量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)低拷貝基因表達(dá)量的快速、準(zhǔn)確定量。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)4是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù),它有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,測(cè)得未經(jīng)PCR信號(hào)放大之前的起始模板量。其反應(yīng)體系中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累加,熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。這樣就可以根據(jù)指數(shù)擴(kuò)增期的產(chǎn)物熒光強(qiáng)度來(lái)推算初始模板的量。與傳統(tǒng)PCR 方法相比,它具有定量準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好,而且操作簡(jiǎn)便、安全、

11、快速等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR從原理上有兩大類熒光模式:一是熒光雜交探針,二是雙鏈DNA內(nèi)插染料。前一種方法特異性好,除需要合成序列特異引物外,還需要合成高成本的熒光探針,成本較高;后一種方法經(jīng)濟(jì),使用方便,只需合成序列特異引物,沒(méi)有序列特異性,可以用于不同的模板。但正是由于熒光染料可以和任何的雙鏈DNA結(jié)合,因此DNA引物二聚體或其他非特異擴(kuò)增產(chǎn)物可以對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。通過(guò)摸索優(yōu)化反應(yīng)條件和熒光捕捉點(diǎn)、建立簡(jiǎn)單實(shí)用的標(biāo)準(zhǔn)曲線、用溶解曲線和凝膠電泳證實(shí)等手段,解決或彌補(bǔ)DNA 結(jié)合染色的不足,成功建成了可檢測(cè)DNA和mRNA的SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)平臺(tái)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

12、已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室一種特異性、高敏感性的定量檢測(cè)基因表達(dá)的有效方法。 3.2熒光定量PCR技術(shù)在水稻氮素基因表達(dá)中的應(yīng)用 從分子生物水平上尋找提高植物氮素利用率的調(diào)控基因的研究還只有10多年的時(shí)間,其相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)調(diào)控特征,特別是生理功能還不是很清楚。目前有學(xué)者將研究的重點(diǎn)集中在部分與氮素代謝相關(guān)的基因上,李寶珍等5以粳稻品種武運(yùn)粳7號(hào)為供試品種,研究了氮饑餓7d后,恢復(fù)供應(yīng)不同形態(tài)氮源(NH4+、NO3-、NH4NO3)在0.596.0h對(duì)水稻氮的吸收和積累及氮還原同化中關(guān)鍵酶的生理差異和相關(guān)基因的調(diào)控,同時(shí)利用基因芯片對(duì)水稻恢復(fù)供應(yīng)不同形態(tài)氮素4d后所調(diào)控表達(dá)的基因進(jìn)行了分析,鑒定到一批受

13、NH4+或NO3-特異誘導(dǎo)的基因上游序列的順式調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子及其他可能影響氮素吸收和利用的功能基因。張啟發(fā)實(shí)驗(yàn)室6在2006年利用包含11 494個(gè)水稻ESTs序列的cDNA芯片研究了水稻苗期在短時(shí)間(20120min)內(nèi)低氮脅迫下響應(yīng)的基因,研究表明,與正常氮處理比較,低氮脅迫響應(yīng)的基因主要在水稻根系,葉片組織中沒(méi)有檢測(cè)到差異顯著的基因。施衛(wèi)明實(shí)驗(yàn)室也運(yùn)用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)鑒定水稻苗期不同硝銨比例下氮素吸收代謝基因群的表達(dá),從基因表達(dá)量水平較為全面地證明了水稻硝促銨原理7,8,但該研究只做了水稻幼苗期和單個(gè)水稻品種,而未證明水稻全生育期氮素基因表達(dá)的變化和品種之間的表達(dá)差異。 4熒光定量

14、PCR技術(shù)在水稻氮素基因表達(dá)中的研究展望 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù),通過(guò)使用特異引物,對(duì)水稻中NH4+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、編碼GS的基因和編碼GOGAT的基因在轉(zhuǎn)錄水平上,進(jìn)行了不同氮素利用基因型水稻品種在各個(gè)生育期、不同氮素水平下的表達(dá)量的定量分析9,10,成功建立了可檢測(cè)水稻氮素吸收利用相關(guān)基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)平臺(tái)。該方法具有很好的準(zhǔn)確性和實(shí)用性,可以為作物遺傳育種建立篩選、農(nóng)業(yè)合理施肥、保護(hù)生態(tài)環(huán)境提供精確的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。 5參考文獻(xiàn) 1 曹桂蘭,張媛媛,樸鐘澤,等.水稻不同基因型耐低氮能力差異評(píng)價(jià)J.植物遺傳資源學(xué)報(bào),2006,7(3):316-320

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