異丙嗪對大鼠急性前腦缺血再灌注線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響

1、異丙嗪對大鼠急性前腦缺血再灌注線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響    【摘要】  目的：觀察不同濃度異丙嗪對大鼠急性前腦缺血再灌注線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)的影響，并從分子水平探討其神經(jīng)保護作用的機制。方法：用夾閉雙側(cè)頸總動脈再開放法制作全腦缺血模型。大鼠隨機分為缺血再灌注+異丙嗪組(治療組)，假手術(shù)+異丙嗪組(假手術(shù)組)，缺血再灌注+NS(模型組)；術(shù)前1h靜注不同濃度異丙嗪(5，15，45mg/kg)，術(shù)后6h3組均分離前腦線粒體，用分光光度法檢測MPT值。結(jié)果：模型組分別與治療組(異丙嗪濃度為5mg/kg時)和假手術(shù)組(異丙嗪濃度為5，15mg/k

2、g時)比較，模型組 MPT值減小更為明顯(P<0?01)；組內(nèi)比較，異丙嗪濃度為5，15mg/kg時比濃度為45mg/kg時抑制MPT值減小的作用更為顯著 (P<0?05)。結(jié)論：異丙嗪能抑制缺血再灌注所致的MPT值的改變，因而可以通過阻止神經(jīng)細胞線粒體的損傷發(fā)揮腦保護作用。 【關(guān)鍵詞】  異丙嗪 缺血再灌注 腦 線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換 神經(jīng)細胞保護   AbstractObjective: To observe the effects of promethazine at different concentrations on mitochondria

3、l permeability transition(MPT)of acute ischemia_reperfusion in rat fore_brain, and to explore the neuron_protective mechanism in mole_cular level. Methods: Acute ischemia_reperfusion models in rat brain were made by reopening both sides common carotid artery after clipping. Rats were assigned into i

4、schemia_reperfusion with promethazine group,sham operation with prome_thazine group and ischemia_reperfusion withnormal saline group. Promethazine at different concentrations(5，15，45mg/kg)were injected one hour before operation, the mitochondria were extracted from rat fore_head 6 hours after operat

5、ion. The MPT value in all the groups was determined by spectrophotometer. Results: Compared with the groups of ischemia_reperfusion with promethazine(5mg/kg)and sham operation with promethazine(5，15mg/kg), the MPT value decreased significantly in the ischemia_reperfusion with normal saline group(P&l

6、t;0?01). In the same group, the effect of promethazine(5，15mg/kg)was more obvious, compared with 45mg/kg(P<0?05). Conclusion: Promethazine at various concentrations can inhibit the changes of MPT value induced by ischemia_reperfusion in rat fore_brain，therefore the neuron_protective effect may be

7、 produced by preventing neuron mitochondrial impairment.    Key Wordspromethazine; ischemia_reperfusion, brain; mitochondrial permeability transition; protection of neuron   研究表明，具有突出抗組胺作用的吩噻嗪類化合物異丙嗪對動物急性腦缺血再灌注損傷有保護作用，且推斷與對抗脂質(zhì)過氧化并減輕腦水腫有關(guān)1。最近發(fā)現(xiàn)，一系列結(jié)構(gòu)相關(guān)的雜環(huán)族化合物均能阻抑線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)

8、的誘導，進一步抑制細胞死亡相關(guān)蛋白因子的釋放2，因而對腦缺血具有保護作用。本實驗通過建立大鼠急性前腦缺血模型，用差速分級離心法分離神經(jīng)細胞線粒體，測定其MPT值，探討不同濃度異丙嗪對大鼠急性前腦缺血再灌注MPT的影響，為其在缺血再灌注損傷中作為關(guān)鍵因素提供證據(jù)，為麻醉手術(shù)中腦保護提供可能的思路。    1 材料與方法    1?1動物健康一級SD大白鼠(粵北人民醫(yī)院實驗動物中心提供)50只，體質(zhì)量192210g，雌雄各半。    1?2 試劑與儀器異丙嗪(上海禾嘉制藥有限公司，中國)；線粒體制備試劑含蔗糖

9、、乙二醇雙(2_氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、Tris_HCl、BSA(天津市化學試劑三廠，中國)；線粒體蛋白測定試劑含堿性酮、酚試劑、標準蛋白質(zhì)溶液(昆明杰輝公司，中國。國產(chǎn)分析純)；琥珀酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物公司，中國)；MPT測定液含Tris_Mops、 Succicate_Tris、Oligomycin、Rotenone(Sigma公司，美國)，Ca2+(天津市化學試劑三廠，中國)；TGL_16B高速離心機(江陰保利科研器械公司，中國)；超低溫冰箱(北京金輝盛業(yè)公司，中國)；UV240分光光度計(島津公司，日本)。    1?3模型制備大鼠模型制備見

10、參考文獻3，4。    1?4動物分組大鼠隨機分為假手術(shù)+異丙嗪組假手術(shù)組，未行缺血再灌注，僅分離雙側(cè)頸動脈，不夾閉，不放血；根據(jù)術(shù)前1h分別尾靜脈注射異丙嗪 (5，15，45mg/kg)又分為A，B，C 3組，缺血再灌注+NS組(模型組，制備缺血再灌注模型，術(shù)前1h尾靜脈注射NS 1mL)和缺血再灌注+異丙嗪組治療組，制備缺血再灌注模型，根據(jù)術(shù)前1h分別尾靜脈注射異丙嗪(5，15，45mg/kg)又分為A，B，C 3組，共7組，每組6只，8只備用。    1?5樣品采集與處理大鼠術(shù)后6h迅速斷頭取腦，除去小腦和腦干,取前腦。采用低溫

11、差異離心法分離前腦線粒體。分離介質(zhì)(pH 7?4)含0?25mol/L的蔗糖、0?01mol/L的EGTA、0?1mol/L的Tris_HCl和質(zhì)量分數(shù)25%的BSA。整個過程均在 04中進行。線粒體用以上介質(zhì)制成懸浮液后于_70冰箱中保存?zhèn)溆?。用Lowry法測定線粒體蛋白濃度(如蛋白含量偏低，標本棄用)。用琥珀酸脫氫酶試劑盒測定琥珀酸脫氫酶活性(如酶活性偏低，標本在以后的檢測中棄用)。    1?6 指標測定利用MPT增大時線粒體膜內(nèi)、外滲透失衡，導致吸光度明顯減少的原理，用分光光度法(反應條件：25，pH 7?4，線粒體蛋白質(zhì)量濃度0?5mg/mL)檢測MPT

12、值。反應體系(MPT測定液)加入150mol/L的Ca2+為激發(fā)劑，在540nm波長處測定各組不同時間點的吸光度值(MPT值)。    1?7統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS13?0軟件包行t檢驗、方差分析。    2結(jié)果   模型組內(nèi)不同時間點的MPT值無統(tǒng)計學意義(P>0?05)，因此統(tǒng)一選取各組內(nèi)作用6min時的值(因為NS各組值不同)進行組間比較。假手術(shù)組與治療組的組內(nèi)比較見表1、2。組間比較見表3。表1假手術(shù)組不同濃度異丙嗪對MPT值的影響表2治療組不同濃度異丙嗪對MPT值的影響

13、表33)P<0?01結(jié)果顯示，缺血再灌注6h后，MPT值明顯減小。與模型組比，假手術(shù)組與治療組分別給予異丙嗪(5mg/kg、15mg /kg)后，兩組MPT值有不同程度的提高；與假手術(shù)組比，治療組MPT值有所下降。給予最大濃度(45mg/kg)時，假手術(shù)組與治療組MPT值均低于模型組。    3討論自Hunter等首次發(fā)現(xiàn)線粒體膜具有通透性轉(zhuǎn)換(PT)的特性以來，其與神經(jīng)細胞死亡的關(guān)系日益受到人們的關(guān)注。腦缺血再灌注損傷是一多因素共同參與的復雜過程，已有證據(jù)提出了線粒體在細胞死亡中是一個關(guān)鍵開關(guān)的觀點5，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞死亡的胱冬肽酶依賴和非依賴途徑，

14、從線粒體內(nèi)釋放細胞色素C，AIF，SMAC/Diablo等蛋白因子至關(guān)重要6。這些蛋白因子釋放的潛在機制至今仍未明了7。而MPT的誘導被認為是這些潛在機制之一8。有學者發(fā)現(xiàn)雜環(huán)族化合物異丙嗪在動物腦缺血模型中也能產(chǎn)生腦保護作用，但未進一步闡明其在神經(jīng)細胞凋亡的線粒體途徑中的作用及其量效關(guān)系1。本實驗通過治療組與假手術(shù)組之比發(fā)現(xiàn)，給予相同劑量的異丙嗪，在術(shù)后6h行缺血再灌注手術(shù)的大鼠前腦神經(jīng)元線粒體MPT值明顯減小 (P<0?01)，符合缺血再灌注導致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)的大量開放。模型組與治療組之比顯示，前者MPT值減小更為顯著 (P<0?01)，提示藥物可抑制PTP的大量

15、開放，從而使神經(jīng)細胞線粒體MPT值仍保持較高的水平，與國外報道相符2。異丙嗪具有突出的抗組胺作用，也歸類為H1受體阻斷藥。資料表明，組胺對血腦屏障、微血管壁的通透性及腦微循環(huán)的功能具有重要的影響，內(nèi)源性物質(zhì)如組胺、5_羥色胺等均可造成胞內(nèi)鈣濃度的升高9。腦缺血再灌注損傷的中心環(huán)節(jié)就是胞內(nèi)鈣超載10，因此，阻斷鈣超載的上游環(huán)節(jié)，從理論上表明異丙嗪應具有腦缺血再灌注損傷保護作用。在同一組內(nèi)，當藥物質(zhì)量分數(shù)增至45mg/kg時，發(fā)現(xiàn)其抑制MPT值減小作用反而不明顯，提示高濃度異丙嗪對PTP開放的抑制作用減弱。線粒體的早期改變只是凋亡的上游途徑，異丙嗪對缺血再灌注后MPT值的影響可能與其雜環(huán)類結(jié)構(gòu)相關(guān)

16、，但其確切機制還需進一步探討。 【參考文獻】  1呂華瑞， 王志平， 湯允昭. 異丙嗪對大鼠急性前腦缺血再灌注損傷的保護作用J. 中國老年學雜志， 2000， 20(4)： 237-238.2Irina GS， Malini VN， Wenhua Zhang， et al.Clinically approved heterocyclics act on a mitochondrial target and reduce stroke_induced pathologyJ.Exp Med， 2004， 200： 211-222.3冀宏. 解毒通絡(luò)方抗大鼠腦缺血再灌后脂質(zhì)過氧化

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