_豐香_草莓葉片高效再生體系的建立

1、園 藝 學(xué) 報(bào) 2005,32(1):101104 豐香 草莓葉片高效再生體系的建立秦永華 張上隆11* 徐 凱1,2 吳延軍 秦巧平112(1浙江大學(xué)園藝系,農(nóng)業(yè)部園藝植物生長發(fā)育與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,杭州310029;肥230036)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系,合摘 要:以草莓主栽品種豐香(Fragaria!ananassaDuch Toyonoka )葉片為外植體,研究了影響組織培養(yǎng)的多個(gè)因素,建立了高效再生體系。結(jié)果表明:MS+TDZ1 5mgL-1+IBA0 4mgL-1培養(yǎng)基最適于不定芽分化。不同濾光膜(綠膜、紅膜、藍(lán)膜、黃膜)對草莓不定芽的分化具顯著效應(yīng),綠膜和紅膜對芽的分化有明顯促

2、進(jìn)作用,不定芽再生率達(dá)95%以上,平均每個(gè)外植體再生芽數(shù)在25個(gè)以上;而藍(lán)膜和黃膜則不利于芽的分化。不同濾光膜光譜差異主要集中在300700nm,紅、綠膜在該波段光強(qiáng)較弱,而黃、藍(lán)膜和熒光燈較強(qiáng)。暗處理4周比1、2、3周更有利于提高葉片的不定芽再生率,此后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng),獲得的不定芽再生率可達(dá)100%。關(guān)鍵詞:草莓;濾光膜;不定芽再生;暗處理中圖分類號:S668 4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0513 353X(2005)01 0101 04AHighlyEfficientSystemEstablishmentofShootRegenerationfromLeafExplantsofStrawb

3、erryQinYonghua,ZhangShanglong,XuKai,WuYanjun,andQinQiaoping11*1,211(1DepartmentofHorticulture,ZhejiangUniversity,TheMinistryofAgriculturalLaboratoryofHorticulturalPlantGrowth,2DevelopmentandBiotechnology,Hangzhou310029,China;DepartmentofHorticulture,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)Abst

4、ract:Anefficientandreliablemethodforshootregenerationfromleafdisksofstrawberry(FragariaananassaDuch Toyonoka )wasestablished.TheoptimummediumforshootregenerationwasMSsupple-1-1mentedwiththidiazuron(TDZ)1 5mgLandIndole 3 butyricacid(IBA)0 4mgL.DifferentKeywords:Strawberry;Colorplasticfilms;Systemofre

5、generation;Darktreatment1 目的、材料與方法本研究以草莓 豐香 (Fragaria!ananassaDuch Toyonoka )葉片為試材,在篩選最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,研究了不同濾光膜和暗處理對不定芽分化的影響,目的是在最短的時(shí)間里建立起高效、穩(wěn)定的草莓離體再生體系,為今后深入開展遺傳轉(zhuǎn)化及無性系變異的篩選提供理論技術(shù)依據(jù)。取2030d葉齡的組培苗,棄去葉緣和葉尖,切成0 2cm!0 2cm小塊接種于不同分化培養(yǎng)基收稿日期:2004-03-09;修回日期:2004-05-24shlzhangzju edu cn)基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30170648)*通訊作

6、者Athorforcorrespondence(E mai:l102園 藝 學(xué) 報(bào)32卷中篩選最適分化培養(yǎng)基,在此基礎(chǔ)上研究不同濾光膜和暗處理對不定芽分化的影響。每個(gè)處理重復(fù)5次,每皿接15個(gè)外植體。再生培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,蔗糖30gL和瓊脂7 0gL,附加不同組合的植物生長調(diào)節(jié)劑,pH5 8,121#滅菌20min,然后分裝到直徑9cm的無菌培養(yǎng)皿中,每皿20mL。接種后將培養(yǎng)皿置于不同條件下培養(yǎng),每兩周繼代1次。培養(yǎng)室條件為:溫度(252)#,光照強(qiáng)度2000lx,光照時(shí)間15h/d。將接種在培養(yǎng)皿中的外植體置于黃、藍(lán)、紅、綠4種濾光膜(上海偉康有色薄膜廠)下培養(yǎng),以熒光燈下培養(yǎng)為對

7、照。用便攜式分光光譜輻射儀LI 1800(LI COR,USA)測定不同濾光膜透射光光譜輻射能,測定波段為3001100nm,掃描波長間隔為2nm,輸出的透射光光譜輻射能為量化后的值。將外植體正面接觸培養(yǎng)基接種在最適分化培養(yǎng)基上暗處培養(yǎng),每隔一周取出5皿于光下培養(yǎng),以熒光燈下培養(yǎng)為對照。培養(yǎng)45d,統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理再生不定芽的外植體數(shù)、每個(gè)外植體再生的芽數(shù)和生根株數(shù),計(jì)算不定芽再生率、每個(gè)外植體平均再生芽數(shù)和生根率。-1-12 結(jié)果與分析2 1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽分化的影響MS培養(yǎng)基中附加不同濃度的TDZ、IBA和2 4 D,結(jié)果表明,植物生長調(diào)節(jié)劑的種類與組合對葉片再生不定芽影響很大

8、(表1)。TDZ單獨(dú)使用可以誘導(dǎo)出不定芽,隨其濃度的增加,不定芽再生率逐漸提高,但不定芽玻璃化現(xiàn)象也隨之加-1-1劇。TDZ以1 5mgL為宜。TDZ1 5mgL與IBA配合使用,可顯著提高不定芽的再生率,當(dāng)IBA的濃度為0 4mgL時(shí)不定芽再生率最高。2 4 D不利于芽的分化,濃度提高,不定芽再生率逐漸降低,并且褐化加劇。2 2 不同顏色濾光膜的物理特性及對不定芽形成的影響-1-1以含有TDZ1 5mgL和IBA0 4mgL的-1表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對 豐香 不定芽分化的影響Table1 Effectsofdifferentgrowthregulatorsonshootregener

9、ationof Toyonoka植物生長調(diào)節(jié)劑組合不定芽再生率平均每外植體Growthregulator(mgL-1)Shootregeneration再生芽數(shù)No ofrate(%)budsperexplantTDZIBA2 4 D0 51 01 52 02 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 525 4536 8445 4546 6147 4560 3476 6774 0767 2763 6427 4517 5411 326 7801 291 712 102 382 683 205 784 684 494 001 861 301 171 0000 20 40 60

10、81 00 40 40 40 40 40 20 40 60 81 0MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,研究不同濾光膜和暗處理對草莓葉片不定芽分化的影響。通過分析不同顏色濾光膜波長及對應(yīng)的光強(qiáng)可以看出(表2),波長700nm以上,光強(qiáng)差異不大,波長300700nm之間,紅膜和綠膜光強(qiáng)較弱且基本接近,而熒光燈(對照)、藍(lán)膜和黃膜下光強(qiáng)較高。300400nm波長為紫外線輻射區(qū),紅膜和綠膜下紫外線輻射較弱,黃膜、藍(lán)膜和熒光下則較強(qiáng)。表2 不同色膜內(nèi)透射光光譜成分比較Table2 Spectrumofdifferentcolorplasticfilms膜色Treatment對照Control紅Red綠Green

11、藍(lán)Blue黃Yellow紫外光Ultraviolet(300400nm)0 2820 089(31 67)0 083(29 54)0 170(60 50)0 180(64 06)藍(lán)紫光Blue(400510nm)2 9930 051(1 70)0 133(4 44)1 005(33 58)1 479(49 42)綠光Green(510610nm)3 9150 062(1 58)0 575(14 69)3 195(81 61)0 176(4 50)紅橙光Red(610720nm)1 4730 850(1 58)0 149(14 69)1 229(81 62)0 059(4 50)(Wm-2)近紅

12、光Nearinfrared總輻射Totalradiation(7201100nm)(3001100nm)0 2670 225(84 27)0 231(86 52)0 225(84 27)0 213(79 78)9 2981 624(17 47)1 487(15 99)6 117(65 79)2 426(26 09)注:括號中數(shù)值為不同膜下各波段光譜輻射能占相應(yīng)對照輻射能的百分?jǐn)?shù)(%)。Note:Valuesinparenthesisarepercentofradiantenergyofdifferentlightwavebandsinoverallradiantenergy.培養(yǎng)在不同濾光膜下

13、的外植體,3d后形態(tài)開始發(fā)生變化,邊緣卷曲;1周后外植體膨大為原來的1 5倍以上。兩周后不同處理的外植體的切口開始形成愈傷組織,顏色略有差異,在熒光、藍(lán)膜、1期秦永華等:豐香草莓葉片高效再生體系的建立103黃膜下的愈傷組織淡黃色,略帶紅色;綠膜、紅膜下的為淡黃色。培養(yǎng)3周后,紅膜下的外植體首先出現(xiàn)不定芽,隨后是綠膜、熒光(對照)、藍(lán)膜,最后是黃膜。從表3中可看出,培養(yǎng)45d后,不同濾光膜下不定芽再生率以紅膜和綠膜為最好,其次為熒光、藍(lán)膜,而黃膜最差。每外植體平均再生芽數(shù)以綠膜最高,紅膜次之,黃膜最差。培養(yǎng)50d后,藍(lán)膜和黃膜下的愈傷組織開始褐化死亡(圖版,15)。由此可見,不同濾光膜對豐香草莓

14、不定芽再生的影響很大,綠膜和紅膜有利于不定芽的分化,而黃膜最差。表3 不同濾光膜對 豐香 草莓不定芽形成的影響Table3 Effectofcolorplasticfilmsonshootregenerationof Toyonoka膜色處理Treatment對照Control綠Green紅Red藍(lán)Blue黃Yellow再生頻率Regenerationrate(%)71 6798 2810060 0920 69平均每外植體再生芽數(shù)No.ofbudsperexplant5 8925 7525 115 311 50暗處理時(shí)間Dark(week)12345對照Control表4 暗處理對 豐香 草莓

15、不定芽形成的影響Table4 Effectofdarktreatmentonshootregenerationof Toyonoka再生頻率Regenerationrate(%)29 3137 2961 6710089 8369 92平均每外植體再生芽數(shù)No ofbudsperexplant1 763 646 579 056 545 402 3 暗處理對不定芽形成的影響外植體經(jīng)暗處理后再置于光下培養(yǎng)。隨著暗處理時(shí)間的增加,不定芽的再生率和再生芽數(shù)逐漸提高,達(dá)9 05,遠(yuǎn)高于其它處理(表4,圖版,610)。但暗處理5周后,不定芽再生率和平均每外植體再生芽數(shù)開始降低。由此可見,誘導(dǎo)不定芽再生的最佳

16、暗培養(yǎng)時(shí)間以4周為宜。本試驗(yàn)結(jié)果表明,同一類型外植體,不同的激素類型對豐香不定芽再生的效果完全不同。TDZ是一種具有極高細(xì)胞分裂活性的物質(zhì),它與IBA配合使用能有效地誘導(dǎo)不定芽的再生,并能大量增殖叢生芽。Thomas等%5&認(rèn)為TDZ可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素的生物合成,并可抑制內(nèi)源生長素的降解。另外,2 4 D不利于芽的分化,隨著濃度的增高,葉片的分化能力逐漸降低,而生成大量疏松愈傷組織。%6&Wernicke認(rèn)為,2 4 D促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的作用僅限于一定的濃度范圍內(nèi),超過某一臨界值,反而對細(xì)胞有抑制作用。光對植物的生長發(fā)育、形態(tài)構(gòu)造、光合作用以及物質(zhì)代謝等都具有一定的調(diào)控作用。不同

17、濾光膜對誘導(dǎo)草莓不定芽的分化具顯著的差異,這可能是由于其作用光譜和光受體不同,從而影響草莓在不定芽分化過程中的許多生理生化過程。紫外線是影響植物生長活動(dòng)的重要因子之一,大量研究指出,無論是溫室還是田間,在紫外線輻射(280400nm)下,許多敏感植物的生長和生物量累積都有明顯的降低%7&,說明紫外線輻射對植物生長發(fā)育有明顯的抑制作用。Teramura和Murali研究發(fā)現(xiàn)植物%8&生長在室內(nèi)比在田間對紫外(UV)輻射增加敏感,他們認(rèn)為這可能是由于自然界瞬息萬變的環(huán)境條件鍛煉了植物的抗逆能力,包括抗紫外輻射的能力。本試驗(yàn)表明,紅膜和綠膜對草莓不定芽的分化具有明顯的促進(jìn)作用,這可能

18、是該處理下紫外輻射較弱,而其它濾光膜下相對較強(qiáng)。熒光燈下紫外輻射較強(qiáng),而不定芽分化好于藍(lán)膜和黃膜,我們認(rèn)為熒光實(shí)際上是各種顏色光的集合,其效應(yīng)有別與其他,Aro和Strid等%9&%10&認(rèn)為在白光條件下,可見光輻射強(qiáng),與紫外輻射的比值高,對紫外輻射損傷有一定的修復(fù)作用。除熒光外,各處理大體上隨著光強(qiáng)的減弱,草莓不定芽再生率逐步提高,可能弱光有利于不定芽的分化。參考文獻(xiàn):189193ZhangZH,WuLP,DaiHY,WangGY,ZhaoTY,BiXY,DuGD.Regenerationandtransformationinvitroofthestrawberryvarie28(3):104園 藝 學(xué) 報(bào)32卷ties.ActaHorticulturaeSinica,2001,28(3):189193(inChinese)3 JemmaliA,ElloumiN,KeversC.Vegetativeandgenerativebehaviorofstrawberry(FragariaananassaDuch.)plantsraisedfrominvitrore generationofaxillaryorstipularbuds.ActaBotanicaGallica,2002,149(4):3954044 Passe