烏司他丁對全肝缺血再灌注肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

1、烏司他丁對全肝缺血再灌注肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制趙 東1 , 楊拔賢1 , 閆 征2 , 姜春玲1 , 賈 若1 (1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科；2. 北京大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)摘要：目的：觀察烏司他丁對大鼠全肝缺血再灌注肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制探討。方法：建立大鼠全肝缺血再灌注模型,24只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(C組),全肝缺血30min、再灌注60min組(I組)和缺血前10min靜脈注射烏司他丁+全肝缺血30min、再灌注60min組(U組)。檢測支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中總蛋白含量、肺組織干/濕質(zhì)量比(D/W)、肺組

2、織髓過氧化物酶(myeloperoxidase , MPO)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量，并以RT-PCR方法比較三組大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase , MMP）14 mRNA含量。結(jié)果：(1) 與對照組比較，I組大鼠BALF總蛋白和MPO含量明顯升高（P0.05），烏司他丁可以顯著抑制這種上升;(2) 與對照組比較，I組和U組大鼠D/W和SOD顯著降低（P0.05），而烏司他丁則可以顯著干預(yù)其降低程度;(3) 與對照組比較，I組和U組大鼠肺組織MMP14 mRNA含量顯著增加（P0.05），而烏司他丁則

3、可以顯著干預(yù)其升高程度。結(jié)論：大鼠全肝缺血再灌注可產(chǎn)生嚴(yán)重的肺損傷，烏司他丁可以顯著減輕肺損傷程度，可能的機(jī)制包括抑制肺組織MMP14 mRNA的表達(dá)。關(guān)鍵詞 肺損傷；肝缺血再灌注損傷；烏司他?。换虮磉_(dá)Protective effect and mechanism of ulinastatin on total hepatic ischemia reperfusion associated lung injury in ratsZHAO Dong , YANG Ba-xian , YAN Zheng , JIANG Chun-ling , JIA ruo. 1. Department of

4、Anesthesiology, Peking University Peoples Hospital , Beijing , 100044 , China. 2. Laboratory of Molecular Biology , Peking University Peoples Hospital , Beijing , 100044 , China.Abstract: Objective :To study the role of ulinastatin - a protease inhibitor in protection of lung damage following total

5、hepatic ischemia reperfusion in rat. Methods: Twenty-four healthy male SD rats were randomly divided into three groups (n=8 in each group). Group C was served as sham injury control , group I rats underwent 60 minutes reperfusion after 30 minutes total hepatic ischemia by clamped the hepatic hilum a

6、nd UTI(ulinastatin, 5x104U/kg) was administered to animals in group U 10minutes just before the occlusion . The rats were sacrificed at end point of the operation and the lung tissues were divided into several parts for (1) pathological section; (2) pulmonary MPO and SOD activity; (3) RT-PCR of MMP1

7、4 mRNA. In addition to bronchoalveolar lavage fluid protein (BALFP) content , and lung dry to wet weight ratios (D/W) were respectively examined in each group. Results: (1) Compared to group C, content of MPO in lung tissues and BALFP were much higher in group I and UTI could reverse this tendency s

8、ignificantly（P0.05）; (2) lung D/W and pulmonary SOD were markedly decreased during hepatic ischemia reperfusion, while them were significantly increased in rats pretreated with UTI（P0.05）; (3) In addition, lung tissues MMP14 mRNA showed the same change as D/W. Conclusion: Severe acute lung injury af

9、ter total hepatic ischemia reperfusion in rats was attenuated by UTI which might have a potential inhibition rule of MMP14 mRNA expression in lung tissues. Key words: acute lung injury; hepatic ischemia reperfusion injury; ulinastatin; gene expression.很多手術(shù)需要術(shù)中完全阻斷入肝血流，比如肝臟巨大腫瘤切除、嚴(yán)重肝外傷救治以及肝移植等。而肝門阻斷缺

10、血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)可以產(chǎn)生嚴(yán)重的多發(fā)遠(yuǎn)隔器官損傷，而肺損傷是術(shù)后主要并發(fā)癥之一1。烏司他丁（ulinastatin、UTI）作為一種廣譜的水解酶抑制劑可以減輕氧自由基和炎性因子對機(jī)體的損傷。本研究通過應(yīng)用大鼠全肝門阻斷缺血再灌注損傷模型，觀察烏司他丁對肺損傷的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。材料與方法1 實(shí)驗(yàn)動物與分組：健康雄性SD大鼠（中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供）24只，體重220250。隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(C組)，全肝缺血再灌注組(I組)和烏司他丁處理組(U組)，每組8只。2 動物模型的制備：大鼠術(shù)前禁食12小時(shí)，以2%戊巴比妥鈉（80mgkg-1）

11、腹腔注射麻醉后仰臥位固定于操作臺，備皮消毒后右側(cè)股靜脈置22G套管針補(bǔ)液備給藥（微量輸液泵以10mlkg-1h-1速度補(bǔ)充加溫生理鹽水）。取上腹正中切口逐層剪開腹壁各層并顯露第一肝門，C 組大鼠并不進(jìn)行阻斷，而于顯露第一肝門后90min處死并取材相關(guān)標(biāo)本；I組大鼠以無創(chuàng)動脈鉗阻斷肝蒂30min并于恢復(fù)血運(yùn)60min時(shí)處死大鼠；U組于肝門阻斷前10min經(jīng)股靜脈給與烏司他丁1ml（廣東天普，批號03060803，稀釋濃度：1.25萬單位/ml），余操作同I組，而C組和I組大鼠肝門阻斷前靜脈給與等量生理鹽水。 3 檢測指標(biāo)與方法：(1) 左肺BAFL蛋白測定：術(shù)畢放血處死大鼠后從環(huán)甲膜處切開皮膚及

12、氣管，以14G套管針外殼插管后結(jié)扎右側(cè)肺門，4oC冰鹽水行左側(cè)支氣管肺泡灌洗3次x4ml后收集并3000rpm 離心15min，取上清待測總蛋白含量（考馬斯亮蘭法，南京建成）；(2) 右肺上葉形態(tài)學(xué)觀察：右肺上葉投入10%中性甲醛固定24h，然后依次以50%和75%的酒精固定24h，石蠟包埋切片后行HE染色，5倍光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)改變；(3) 右肺中葉肺組織勻漿MPO和SOD含量：準(zhǔn)確稱取100-200ug右肺中葉組織，加9倍體積的生理鹽水制成10%肺組織勻漿測定髓過氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量（試劑盒購自南京建成）；(4) 右肺下葉肺干濕比（D/W）：稱取濕重(W)后，

13、在50oC溫箱烤48h再稱其干重(D)，D/W表示肺干濕重比；(5) MMP14 mRNA 含量：取-80oC凍存右肺最下葉組織100mg，Trizol一步法提取總RNA。以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法測定MMP14 mRNA相對含量。以18S作為內(nèi)參照。MMP14和18S引物序列均采用Premier3.0軟件自行設(shè)計(jì)并由賽百盛公司合成：MMP14上游5-tgg gta gcg atg aag tct tc-3,下游5-agt aaa gca gtc gct tgg gt-3；18S上游5-gag ctc acc ggg ttg gtt ttg-3, 下游5-tac ctg gtt

14、 gat cct gcc ag-3。其擴(kuò)增產(chǎn)物分別為319bp和250bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠（含EB）電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并攝相、測定灰度值。用MMP14/18S的灰度值比來表示MMP14 mRNA的相對表達(dá)量。4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS12.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。不同組別間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果1形態(tài)學(xué)觀察：光鏡下C組可見肺泡腔完整、間隔均勻一致、肺泡壁光滑偶見PMN；I組可見肺泡壁完整性破壞、肺泡腔有滲出、肺泡間隔增厚、大量PMN浸潤；U組僅見部分肺泡壁完整性破壞、少許滲出、少量PMN浸潤。2大鼠肺干濕重

15、比和BAFL蛋白含量：肺干濕重比（D/W）在C組明顯高于I組和U組(P0.05)；其中U組又明顯高于I組(P0.05)；BALF蛋白含量在C組和U組明顯低于I組(P0.05)(表1)。3大鼠肺組織勻漿MPO、SOD含量和MMP14 mRNA的表達(dá)：MPO活性在I組明顯高于C組和U組(P0.05，表2)；SOD活性在C組明顯高于各手術(shù)組(P0.05)，其中U組又顯著高于I組(P0.05，表2)；MMP14 mRNA的相對表達(dá)量以MMP14 mRNA與18S mRNA表達(dá)量的比值表示，在I組要顯著高于C組和U組(P0.05，表2)。表1 大鼠肺組織干濕重比（D/W）和BAFL蛋白含量（s）Tabl

16、e 1 Lung dry to wet weight ratio and BALFP content（s）Group n D/W (100%) BALF pr (mg/ml) Group C 8 23.81.2 0.540.18 Group I 8 19.70.8* 1.030.45*Group U 8 21.11.3*# 0.640.17#* P0.05, compared with group c; # P0.05, compared with group I.表2 大鼠肺組織勻漿MPO、SOD含量以及MMP14 mRNA表達(dá)量（s）Table 2 MPO, SOD and MMP14 m

17、RNA contents in lung tissues of different group（s） Group n MPO (U/g wet film) SOD（U/mgprot） MMP14 mRNAGroup C 8 2.380.65 23.91.76 0.950.17Group I 8 5.771.69* 14.10.98* 1.870.31*Group U 8 2.490.99# 20.11.53*# 1.120.25#* P0.05, compared with group c; # P0.05, compared with group I.討 論肝缺血再灌注后，枯否細(xì)胞激活并產(chǎn)生

18、大量氧自由基和促炎癥細(xì)胞因子如TNF-a2。后者一方面可以直接增加毛細(xì)血管通透性3，另一方面通過激活NF-kB通路促進(jìn)CXC趨化因子表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear leucocyte,PMN)積聚于肺毛細(xì)血管床4。PMN作為主要的炎性細(xì)胞通過以下幾方面發(fā)揮肺損傷作用：(1)大量PMN淤滯于肺循環(huán)造成微循障礙，通過自身激活的2整合素與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（endothelial cell adhesion molecule 1、ICAM-1）作用后跨內(nèi)皮移行進(jìn)入肺間質(zhì)5；(2) 釋放大量氧自由基氧化細(xì)胞膜雙層磷脂中的多不飽和脂肪酸，從而破壞肺泡的結(jié)構(gòu)

19、和功能6 ；(3) 脫顆粒釋放大量彈性蛋白酶、MPO和MMP等，分解細(xì)胞外基質(zhì)，損傷內(nèi)皮血管和肺泡上皮7，進(jìn)一步增加毛細(xì)血管通透性。MPO是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志酶，特定存在于中性粒細(xì)胞溶酶體內(nèi)，測定肺組織MPO含量可以反映PMN在肺組織內(nèi)的聚集情況。而SOD作為一種具有保護(hù)作用的酶類能清除超氧陰離子氧自由基從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。作為一種在細(xì)胞外基質(zhì)重塑過程中具有重要作用的跨膜金屬蛋白酶，MMP14可通過直接降解細(xì)胞外基質(zhì)分子以及間接促進(jìn)MMP2的表達(dá)發(fā)揮作用。正常狀態(tài)下機(jī)體MMP表達(dá)量很小，起著維持細(xì)胞外基質(zhì)動態(tài)平衡及細(xì)胞凋亡的作用，而在病理狀態(tài)下比如炎癥反應(yīng)中活化的PMN可以釋放出大量的MMP，

20、參與破壞細(xì)胞外基質(zhì)，損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞的基底膜8。近來有研究認(rèn)為MMP14在大鼠腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用9，而上皮細(xì)胞的主要黏附配子胞外基質(zhì)大分子層粘連蛋白5（laminin-5、Ln-5）則可能是MMP14發(fā)揮降解作用的靶蛋白10。但有關(guān)MMP14在肝缺血再灌注肺損傷中作用的研究尚未見報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全肝缺血再灌注組大鼠肺組織HE染色可見肺泡壁完整性破壞、肺泡腔有滲出、肺泡間隔增厚、大量PMN浸潤；由于毛細(xì)血管通透性增高所以肺干濕重比較對照組大鼠顯著降低、BAFL總蛋白含量顯著升高；MPO含量升高說明PMN大量聚集于肺組織，有害氧自由基大量生成從而消耗內(nèi)源性的SO

21、D，所以SOD含量在缺血再灌注組較對照組顯著降低；并且在各種炎性刺激之下，肺組織MMP14 mRNA表達(dá)顯著升高。烏司他?。║TI）又名尿抑制素，是一種從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的廣譜蛋白酶抑制劑，本身是由兩個(gè)kunitz型區(qū)域組成的一種糖蛋白，由143個(gè)氨基酸組成，相對分子量約為67kD。目前認(rèn)為UTI可通過以下機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用：(1) 作為廣譜蛋白酶抑制劑能夠抑制PMN釋放的彈性蛋白酶、組織蛋白酶，從而減輕它們對組織的損傷；(2) 通過抑制PMN的聚集從而減輕肝臟的缺血再灌注損傷11；(3) 穩(wěn)定溶酶體膜，減少溶酶體膜破裂釋放造成的組織損傷12；(4) 清除氧自由基，并抑制PMN

22、釋放的氧自由基11；(5) 抑制PMN、單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-、IL-6等炎性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)促炎與抗炎因子的平衡11；(6) 抑制LPS誘導(dǎo)代謝產(chǎn)物生成并改善血流動力學(xué)狀況13；(7) 通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)14，從而抑制PMN在血管的黏附和逸出作用，減輕I/R損傷時(shí)PMN對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。我們研究的結(jié)論顯示：烏司他丁處理組大鼠肺組織HE染色僅見部分肺泡壁完整性破壞、少許滲出、少量PMN浸潤，較全肝缺血再灌注組有明顯改善；肺干濕重比較I組顯著增加而BAFL蛋白含量顯著下降說明肺毛細(xì)血管通透性有顯著改善；MPO含量下降代表烏司他丁預(yù)處理后肺組織PMN浸潤減少，進(jìn)而抑制氧自由

23、基的釋放，SOD含量顯著增加；而肺組織MMP14 mRNA表達(dá)在烏司他丁處理組也較全肝缺血再灌注組顯著降低，說明UTI具有抑制全肝缺血再灌注肺損傷肺組織MMP14 mRNA表達(dá)的作用?？傊?，大鼠全肝缺血再灌注可產(chǎn)生嚴(yán)重的肺損傷，應(yīng)用烏司他丁可以顯著減輕肺損傷的程度，可能的機(jī)制包括抑制PMN聚集及抑制肺組織MMP14 mRNA的表達(dá)。參考文獻(xiàn)(1) Liu DL, Jeppsson B, Hakansson CH, et al. Multiple-system organ damage resulting from prolonged hepatic inflow interruption. A

24、rch Surg. 1996 Apr;131(4):442-7.(2) Colletti LM, Burtch GD, Remick DG, et al. The production of TNF-a and the development of a pulmonary capillary injury following hepatic ischemia/reperfusion. Transplantation, 1990, 49(2): 268-272.(3) Stephens KE, Ishizaka A, Larrick JW, et al. Tumor necrosis facto

25、r causes increased pulmonary permeability and edema. Comparison to septic acute lung injury. Am Rev Respir Dis. 1988, 137: 1364-70.(4) Colletti LM, Kunkel SL, Walz A,et al. Chemokine expression during hepatic ischemia/reperfusion-induced lung injury in the rat. The role of epithelial neutrophil acti

26、vating protein. J Clin Invest. 1995 Jan;95(1):134-41.(5) Zimmerman GA, Albertine KH, Carveth HJ, et al. Endothelial activation in ARDS. Chest, 1999, 116, Supplement, 18S-24S.(6) Compton CN, Franko AP, Murray MT, et al. Signaling of apoptotic lung injury by lipid hydroperoxides. J Trauma. 1998, 44: 7

27、83-788.(7) Fujishima S, Aikawa N. Neutrophil-mediated tissue injury and its modulation. Intensive Care Med. 1995, 21: 277-285.(8) Carney DE, Lutz CJ, Picone AL, et al. Matrix metalloproteinase inhibitor prevents acute lung injury after cardiopulmonary bypass. Circulation. 1999, 100: 400-406.(9) Covington MD, Burghardt RC, Parrish AR. Ischemia-induced cleavage of cadherins in NRK cells requires MT1-MMP (M