桑黃胞外多糖對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

1、842014；Vol48No9上海中醫(yī)藥雜志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，桑黃胞外多糖對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用蔡國(guó)云，張李金鳳，艷，水冰潔，范永升，丁興紅杭州310053）將60只Wistar大浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（浙江【摘要】目的研究桑黃胞外多糖對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠的治療效果，并探討其治療機(jī)制。方法鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，桑黃胞外多糖低、中、高劑量組，每組10只，連續(xù)給藥30天。采用組織容積法測(cè)定關(guān)節(jié)腫脹ELISA法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-程度，關(guān)節(jié)病理切片觀察關(guān)節(jié)組織病理情況，（TNF-）、白介素-1（IL-1）、白介素-17（IL

2、-17）的表達(dá)水平。結(jié)果與空白組比較，模型組各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。與模型組比較，各治療組均能抑制非致炎足足趾腫IL-1、IL-17的表達(dá)（P005）。與陽(yáng)性藥對(duì)照比較，脹（P005），桑黃胞外多糖改善關(guān)節(jié)組織病理情況，顯著降低血清中TNF-、IL-1、IL-17的表達(dá)及桑黃胞外多糖低劑量組TNF-IL-1的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。桑黃胞外多高、中劑量組TNF-、IL-1的表達(dá)與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。結(jié)論糖高劑量組血清中TNF-、果，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-B信號(hào)通路和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的?！娟P(guān)鍵詞】桑黃胞外多糖；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；腫瘤壞死因子

3、-；白介素-1；白介素-17【中圖分類號(hào)】2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-1334（2014）09-0084-04桑黃胞外多糖對(duì)CIA大鼠有一定的治療效ImmunoregulatoryeffectsofPhellinusigniariusextracellularpolysaccharideoncollagen-inducedarthritisratsLIJin-feng，CAIGuo-yun，ZHANGYan，SHUIBing-jie，F(xiàn)ANYong-sheng，DINGXing-hongZhejiangChineseMedicalUniversity，HangzhouAbst

4、ract：ObjectiveToexplorethetherapeuticeffectsofPhellinusigniariusextracellularpolysaccharideoncollagen-inducedarthritis（CIA）ratsMethodsSixtyWistarratswererandomlydividedinto6groups：blankgroup，modelgroup，controlgroup，3treatmentgroupswithPhellinusigniariusextracellularpolysaccharide，with10ratsineachgro

5、up，andtheratswerecontentiouslyadministratedfor30daysThepawvolumewasmeasuredtodeterminejointswellingdegreeThepathologicalsectionsofanklewereobservedundermicroscopeThelevelsofTNF-，IL-1，IL-17weredeterminedbyELISAesultsThereweresignificantdifferencesintheindexesbetweentheblankgroupandthemodelgroup（P005）

6、Comparedwiththemodelgroup，eachtreatmentgroupcandecreasethepawswellingdegree（P005），improvejointtissuepathologicalsituation，decreasethelevelsofTNF-，IL-1，IL-17significantly（P005）Comparedwiththepositivedruggroup，nosignificantdifferencewasfoundintheexpressionsofTNF-，IL-1andIL-17inhighdoseandmediumdosegro

7、ups，andTNF-andIL-1inlowdosegroup（P005）NosignificantdifferencewasfoundintheexpressionsofTNF-andIL-1betweenhighdosegroupandblankgroup（P005）ConclusionPhellinusigniariusextracellularpolysaccharidehasatherapeuticeffectonCIArats，anditsmechanismmaybethroughinhibitingtheexpressionofNF-Bpathwayandtheexpressi

8、onofinflammatorycytokinesKeywords：Phellinusigniariusextracellularpolysaccharide；collagen-inducedarthritis；TNF-；IL-1；IL-17A）是一種以類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的全身性自身免疫病，其主要病變特點(diǎn)是由滑膜炎引起的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。本病是一種常見風(fēng)濕免疫病，1全世界發(fā)病率約為05%1%。目前，非甾體抗炎藥（NSAIDs）、糖皮質(zhì)激素等是治療本病的主要藥物，可基金項(xiàng)目浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14H270

9、014）作者簡(jiǎn)介李金鳳，女，碩士生，主要從事微生物與生化藥學(xué)方面研究工作。通訊作者丁興紅，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：zmkm1978126com以在一定程度上減輕由炎癥引起的疼痛，但也存在明2顯的毒副作用，導(dǎo)致患者的依從性差。多糖作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，在治療近年來(lái)，3和預(yù)防類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面取得了積極進(jìn)展。桑黃是4具有一種珍貴的藥用真菌，其主要活性成分為多糖，56可用于治療自身抗炎等功效，抗腫瘤、保肝護(hù)肝、7免疫性關(guān)節(jié)炎。本研究以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠為模型，觀察桑黃胞外多糖對(duì)CIA大鼠足趾腫脹度、血清中腫瘤壞死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）、白介素-17（IL-1

10、7）的影響，并探討桑黃胞外多糖治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制，為桑黃多糖臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。2014；Vol48No9上海中醫(yī)藥雜志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，851材料與方法11材料111動(dòng)物6周齡清潔級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量130160g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。112藥物與試劑桑黃（Phellinusigniarius），購(gòu)于美國(guó)典型菌種保藏中心ATCC（編號(hào)：36121）?？ń槊?，無(wú)錫上海生物制品研究所（批號(hào)：200703001）；石蠟油，江蘇永海碩生物有限公司（批號(hào)：20101123）；羊毛脂

11、，華精細(xì)化學(xué)品有限公司（批號(hào)：20110305）；BovineTypeChondrex（批號(hào)：20022）；塞來(lái)昔布，輝瑞制Collagen，IL-1、IL-藥有限公司（批號(hào)：BK12CCEK107）；TNF-、17試劑盒，聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。113儀器電子天平（BS124S），賽多利斯科學(xué)儀器Sanyo；冷凍恒溫振有限公司；高壓滅菌鍋（MLS-3750），D），蕩器（DHZ-太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；酶標(biāo)儀（MK3），ThermoMultiskan；振蕩器（QB8002），Qilinbeier；渦旋混Qilinbeier；離心機(jī)（LX200），Qilinbeier；足合器（KB3），趾容積測(cè)量?jī)x（

12、YLS-7B），安合盟（天津）科技有限公司。12藥物制備將桑黃（Phellinusigniarius）菌種22、160r/min培養(yǎng)710天。按參考文獻(xiàn)8方法，抽濾獲得不含菌絲體發(fā)酵液，減壓濃縮至1/5，加入4倍體積的無(wú)水乙醇使其終濃度為80%，4沉淀多糖8h，過(guò)濾沉淀洗滌，干燥得到桑黃胞外多糖。配制桑黃胞外多糖溶液，濃度分別為低（100g/g）、中（200g/g）、高（400g/g）。塞來(lái)昔布劑量為263g/g。13分組、造模及給藥將60只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，桑黃胞外多糖低、中、高劑量組，每組10只。取20ml液體石蠟與10ml羊毛脂，加熱、超聲，使121

13、高壓其混合均勻，制成弗氏不完全佐劑（IFA），4冰箱保存?zhèn)溆?。?mlIFA，滅菌60min，加入卡介苗，使其終濃度為5g/L。研磨均勻制成弗氏完全佐劑（CFA），加入等體積的BovineTypeCollagen（005mol/L醋酸溶解），制成牛C-冰浴研磨均勻，CFA乳劑。除空白組外，其余各組均在大鼠的右后足CFA乳劑致趾皮下和尾根部各注射01ml的牛C-7天后在大鼠尾根部注射01ml加強(qiáng)免疫，炎，空白組2則在相應(yīng)的部位注射等量的09%NaCl溶液。模型組灌造模后第15天開始灌胃給藥：空白組、胃09%NaCl溶液，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃塞來(lái)昔布263g/g，桑黃胞外多糖低、中、高劑量組分別灌胃相應(yīng)

14、的劑量的桑黃胞外多糖溶液。每只大鼠每天灌胃1次，每次2ml，連續(xù)給藥30天。14取材及指標(biāo)檢測(cè)141大鼠形態(tài)觀察采用關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分法9（0分1分表示個(gè)別足趾發(fā)紅、2分表示腫脹，表示無(wú)關(guān)節(jié)炎，3分表示踝關(guān)節(jié)及以下腫脹，大部分足趾及足底腫脹，4分表示腫脹累及踝關(guān)節(jié)以上且不能負(fù)重，四肢關(guān)節(jié)最高得分為16分，大于4分認(rèn)為關(guān)節(jié)炎癥誘導(dǎo)成功）評(píng)價(jià)CIA大鼠造模成功與否。142大鼠關(guān)節(jié)病理給藥30天后，將大鼠麻醉處死，截取大鼠非致炎足左后肢，做關(guān)節(jié)病理切片（HE染色），顯微鏡觀察大鼠的關(guān)節(jié)組織病理情況。143大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度給藥前1天采用足趾容積測(cè)量法測(cè)定大鼠足趾腫脹容積，給藥后每隔4天測(cè)定一次。通過(guò)各組大鼠

15、的足趾容積的差異來(lái)評(píng)價(jià)各給藥組的治療效果。144大鼠血清細(xì)胞因子含量給藥30天后，將大3000r/min離鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置30min后，ELISA法測(cè)定TNF-IL-1、心10min，取上層血清，、IL-17含量。15統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS190統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果21大鼠形態(tài)觀察除空白組外，各組大鼠造模第1天右后足出現(xiàn)原發(fā)性腫脹，第14天出現(xiàn)繼發(fā)性腫脹。造模后大鼠右后足關(guān)節(jié)腫脹明顯，并逐漸累及左后足及前肢關(guān)節(jié)，嚴(yán)重時(shí)雙后足不能負(fù)重，飲食及活動(dòng)減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)較慢，毛色無(wú)光澤，關(guān)節(jié)評(píng)分均大于4分

16、，確定造模成功。22大鼠關(guān)節(jié)組織的病理觀察空白組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞一般為13層，排列致密有序。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞明顯增多，且出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有血管翳生成，與關(guān)節(jié)軟骨組織粘連，造成軟骨侵蝕和破壞，表明造模成功。陽(yáng)性對(duì)照組中，滑膜與軟骨粘連情況明顯減輕，且侵入軟骨腔的滑膜逐漸退出，滑膜細(xì)胞增生和炎癥浸潤(rùn)也有所減少。桑黃胞外多糖低劑量組滑膜與軟骨粘連比較嚴(yán)重，中劑量組中粘連情況有所減輕但軟骨表面仍不光滑，高劑量組的病變情況較模型組和低、中劑量組明顯減輕，滑膜細(xì)胞數(shù)量和血管翳較模型組減少，軟骨的侵蝕和破壞程度也有所減輕，且軟骨表面較光滑。見圖1。23對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度的影響開始給藥

17、后824天期間各給大鼠左后足足趾腫脹程度開始降低，藥組與模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。陽(yáng)性對(duì)照組抑制效果最為明顯，在820天期間與胞外多糖低、中、高劑量組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。桑黃胞外多糖低、中、高劑量組抑制大鼠足趾腫脹程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。第24天桑黃胞外多糖高、中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組足趾腫脹程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005），而桑黃胞外多糖低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。第28天各給藥組與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。見表1。862014；Vol48No9上海中醫(yī)藥雜志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，注：A空白組；B模型

18、組；C陽(yáng)性對(duì)照組；D胞外多糖低劑量組；E胞外多糖中劑量組；F胞外多糖高劑量組表1200)圖1大鼠關(guān)節(jié)病理組織觀察(HE，s，ml)各組CIA大鼠足趾腫脹程度比較(n=10組別空白組模型組陽(yáng)性對(duì)照組0d1086070120020176*19260153*20080270*19790180*19150100*16d1162006116540087*12740086*14760134*14000055*13940065*#4d1074009219750234*18040125*19240246*18280112*18180084*20d1190007514380078*12210063#136600

19、93*13080094*12980068*#8d1070007518170126*15160083*16920228*16670101*16640133*24d1191005513750041*11860049#12990096*12410088#12390038#12d1102003316950103*13200121*15800182*14690068*14600091*28d1221013013180082*11550073#12220108#12130083#12080047#桑黃胞外多糖低劑量組桑黃胞外多糖中劑量組桑黃胞外多糖高劑量組組別空白組模型組陽(yáng)性對(duì)照組桑黃胞外多糖低劑量組桑黃

20、胞外多糖中劑量組桑黃胞外多糖高劑量組*P005；與模型組同期比較，#P005；與陽(yáng)性對(duì)照組同期比較，注：與空白組同期比較，P00524對(duì)大鼠血清中細(xì)胞因子的影響與空白組比較，IL-1、IL-17含量顯著升高，模型組大鼠血清中TNF-、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和桑黃胞外多糖高、中、低劑量組大鼠血清中TNF-IL-1、IL-17含量降低，、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。桑黃胞外多糖各劑量組血清中TNF-含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005），且桑黃胞外多糖高劑量組與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義n=10，ng/L)表2各組大鼠血清細(xì)胞因子含量比較(s，組別空白組

21、模型組陽(yáng)性對(duì)照組桑黃胞外多糖低劑量組桑黃胞外多糖中劑量組桑黃胞外多糖高劑量組TNF-32162133807114*3544257*3597197*3585260*#（P005）。桑黃胞外多糖各劑量組血清中IL-1含量與陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。桑黃胞外多糖高、中劑量組血清中IL-17含量與陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。與桑黃胞外多糖低劑量組IL-1含量差異比較，桑黃胞外多糖高劑量組TNF-、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。與桑黃胞外多糖中劑量組比較，桑黃胞外多糖高劑量組TNF-含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。見表2。IL-157292556840286*5782282#60

22、04323*5795221#5633234#IL-1734151624012315*3546256#3736141*3676139*3597139*#3370254#*P005；與模型組比較，#P005；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P005；與胞外多糖低劑量組比較，P005；與胞外多糖中劑量組注：與空白組比較，比較，P0052014；Vol48No9上海中醫(yī)藥雜志2014年第48卷第9期SHJTCMSep，873討論類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中多種細(xì)胞因子關(guān)系密IL-1等基因的轉(zhuǎn)錄水平，通路，降低TNF-、并通過(guò)抑IL-1、IL-17細(xì)胞因子的表達(dá)，制TNF-、降低Th細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的免疫應(yīng)答，起

23、到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。本研究表明，桑黃胞外多糖對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎有一定的治療效果，為臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供了一定的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)：左曉霞，1EdwardD，HarrisJr凱利風(fēng)濕病學(xué)M陶立堅(jiān)，高潔生，2006：853-877譯北京：人民衛(wèi)生出版社，2谷恒存，丁興紅，馬哲龍，等蘄蛇水提液對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的免中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（10）：2676-2678疫調(diào)節(jié)作用JJ中國(guó)3陳燕，李世剛中藥多糖防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展2011，17（1）：202-204實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，中國(guó)食用菌，2012，134張林芳，鄒莉桑黃多糖的研究進(jìn)展J（4）：1-45WeiD，LiN，LuWD

24、，etalTumor-inhibitoryandliver-protectiveeffectsofPhellinusigniariusextracellularpolysaccharidesJWorldJMicrobiolBiotechnol，2009，25（4）：633-6386JangBS，KimJC，BaeJS，etalExtractsofPhellinusgilvusandPhellinusbaumiiinhibitpulmonaryinflammationinducedbylipopolysaccharideinratsJBiotechnolLett，2004，26（1）：31-33

25、7DaiYC，ZhouLW，CuiBK，etalCurrentadvancesinPhellinussensulato：medicinalspecies，functions，metabolitesandmechanismsJApplMicrobiolBiotechnol，2010，87（5）：1587-15938樊錦艷，王秋穎，薛梅，等桑黃胞外多糖生產(chǎn)培養(yǎng)基的初步研究J食品科技，2004（2）：93-959張宏民云南白藥對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎干預(yù)性研究D2013昆明：昆明醫(yī)科大學(xué)，10高自立，董秋梅，王濱，等蒙藥忠倫阿湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠中醫(yī)雜志，2012，53（7）：599-602血清

26、炎性細(xì)胞因子的影響J11KimGY，KimSH，HwangSY，etalOraladministrationofproteoglycanisolatedfromPhellinuslinteusinthepreventionandtreatmentofcollagen-inducedarthritisinmiceJBiolPharmBull，2003，26（6）：823-83112張軍芳，蔣飛霞，張宜，等細(xì)胞因子與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展J現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12（4）：735-73813母?jìng)髻t，劉國(guó)玲，田華，等川芎嗪對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1、IL-6、IL-2水平及關(guān)節(jié)浸液NO、P

27、GE2的影響J中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合2014，34（2）：214-217雜志，MMP-9、NF-14王秦IL-1、B在大鼠膠原關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中的表達(dá)D太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2006及相關(guān)性研究15梁秀軍，翟澤玲，董文娟，等膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠炎性細(xì)胞因子的動(dòng)J中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21（3）：57-60態(tài)觀察哈爾16白洪宇大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c評(píng)價(jià)D2009濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，17林琳類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者TH17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及D大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2011臨床意義18劉偉偉，高永翔，趙靜，等青藤堿對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Th17的影響J中醫(yī)臨床研究，2014，6（6）：137-139研究進(jìn)展19丁福秀卡介菌多糖核酸輔助治療對(duì)初始涂陽(yáng)肺結(jié)核患者血清VIP和IL-17的影響J中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2012，7（24）：34-36切，構(gòu)成一個(gè)參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎整個(gè)病理過(guò)程的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，具有免疫調(diào)節(jié)作用10。TNF-是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中重要的致炎細(xì)胞因子，能促進(jìn)細(xì)胞因子分泌、表達(dá)黏附分子、增殖和