免疫熒光雙染

1、免疫熒光雙染在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時，需進行雙重熒光染色。雙重免疫熒光標記法（double immu nofluoresce neelabeli ng method） 也分為直接法和間接法。服務說明冰凍切片熒光tunel +免疫熒光雙標實驗步驟1、冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3 次,每次5min。2、修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內滴加蛋白酶 K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織, 37度溫箱孵育30min。將玻片置于 PB

2、S（ PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗 滌3次，每次5min。3、破膜：切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（ PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min4、 加試劑1,2 :按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 （TdT）和試劑2（dUTP）按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn)用），加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37C恒溫孵育2小時，濕盒內加少量水保持濕度。5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（ PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3次， 每次 5min ，在圈內滴加 用 3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉 30min。6

3、、加一抗： 輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗， 切片平放于濕盒內4 °孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）7、 加二抗：玻片置于PBS（ PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的 二抗 覆蓋組織， 避光室溫 孵育 50min 。8 DAPI復染細胞核：切片用PBS（ PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS 后在圈內滴加 DAPI 染液，避光室溫孵育 10min。9、封片： 玻片置于 PBS （PH7.4） 中在脫色搖床上晃動洗滌 3次，每次5min 。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。1

4、0、鏡檢拍照： 切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。 （紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm; FITC綠光激發(fā)波長465-495nm， 發(fā)射波長 515-555 nm； CY3 紅光激發(fā)波長 510-560，發(fā)射波長 590nm）石蠟切片 熒光tunel+免疫熒光雙標 實驗步驟1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯 I 15-20mi n-二甲苯n 15- 20min-無水乙醇I 10min-無水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗（冬天脫蠟時間稍微延長）。2、修復： 切片稍甩干后用組化筆在組織

5、周圍畫圈（防止液體流走），在圈內滴加蛋白酶 K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織,37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS ( PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。3、破膜： 切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS( PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。4、 加試劑 1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel 試劑盒內適量試劑1 (TdT)和試劑2(dUTP)按2:29混合，加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕 盒內，37C恒溫箱孵育2小時，濕盒內加少量水保持濕度。5、 BSA封閉:將玻片置于PBS

6、 ( PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫圭寸閉30min。6、 加一抗： 輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS 按一定比例配好的一抗， 切片平放于濕盒內 4°C 孵育過夜。 (濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā))7、 加二抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3次，每 次 5min 。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的 二抗 覆蓋組織， 避光室溫 孵育 50min。8 DAPI復染細胞核： 切片用PBS ( PH7.4)洗滌3次，每次5min。去除 PBS后在圈內滴加 DAPI染液，避光室溫孵育10min。9、封片： 玻片置于 PBS(PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。10、鏡檢拍照： 切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm; FITC綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長 515-555 nm； CY3 紅光激發(fā)波長 510-560，發(fā)射波長 590nm)注意事項1熒光染色后一般在1