實時定量PCR技術綜述

1、實時定量PCR技術綜述一基本原理 1.PCR反應動力學 右圖為PCR反應曲線（橫坐標為循環(huán)數，縱坐標表征產物量），不同的曲線代表初始模板量不同的 PCR反應。PCR反應的動力學公式為： Cn=C0(1+E)n 其中C0和Cn分別為初始模板和n循環(huán)的拷貝數，n為循環(huán)數，E為擴增效率（0E1），理想狀態(tài)下（即每個循環(huán)中所有模板均與引物結合并等到擴增），E為1。 由上圖可知，只有在線性區(qū)段E值才為定值，這樣才能通過檢測Cn定量C0，由于終點檢測不能保證在線性區(qū)段，所以重復性不好，實時檢測（每個循環(huán)檢測一次）技術解決了這個問題。 2.定量PCR原理 定量PCR是將待測標本與一系列濃度（C0）

2、已知的標準品在同一條件下共同擴增，并進行實時檢測，根據標準品的檢測值及已知的C0值作出標準曲線，如右圖（橫作標為的C0對數值），再根據待測標本的檢測值在標準曲線上查到待測標本的C0值。 3.信號產生 目前定量PCR技術信號產生都是基于FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波長的光激發(fā)下，一個熒光基團A發(fā)光，并且被鄰近的另一個熒光基團B吸收，使熒光基團B發(fā)光。如檢測熒光基團A，應在FRET消除后；如檢測B，則應在FRET發(fā)生時檢測。 根據信號產生方式的不同可將定量PCR技術分為三類：Taq

3、Man Probes技術；Hybridization Probes技術；Molecular Beacons技術。 TaqMan Probes技術（右圖A）是Perkin Elmer公司1995年研制，利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶53外切酶活性，將TaqMan 探針5端熒光基團切去，使之與3端熒光基團分離、熒光淬滅消失，在特定波長下檢測5端熒光基團即可表征PCR產物的量。 Hybridization Probes技術（右圖B）是Roche公司建立的，PCR反應退火過程中，兩個探針與模板雜交（相鄰一個堿基），發(fā)生FRET，這時檢測第二

4、個熒光基團即可表征PCR產物的量。Hybridization Probes技術要求熱穩(wěn)定DNA聚合酶不具備53外切酶活性，而是在引物延伸過程中被取代，使探針可在下一循環(huán)再與模板雜交，如探針被降解，可導致定量不準。 Molecular Beacons技術（上圖C）利用莖環(huán)結構的探針，當形成莖環(huán)結構時，發(fā)生熒光淬滅，退火過程中，探針與模板雜交，熒光淬滅消失，在特定波長下檢測5端熒光基團即可表征PCR產物的量。二.熒光標記1.TaqMan ProbesTaqMan探針通常在5端以熒光基團FAM標記，靠近3端以熒光基團TAMRA標記，3端磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。下

5、表列出了兩種熒光基團的吸收及發(fā)射波長。 FAM TAMRA 吸收波長 492 547 發(fā)射波長 518 573 2.Hybridization ProbesHybridization探針技術中，上游donor Probe 3端以熒光基團Fluorescein標記；下游acceptor Probe 5端以Roche的LC-Red 640標記（當用雙熒光基團時還可同時使用LC-Red 705），3端磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。也有文獻報道acceptor Probe 5端以Cy5標記，下表列出了各種熒光基團的吸收及發(fā)射波長。 Fluorescein LC-Red

6、640 LC-Red 705 Cy5 吸收波長 494 625 685 643 發(fā)射波長 519 640 705 667 3.熒光標記基團與PCR儀的激發(fā)與檢測波長由于熒光標記基團的選擇還受到定量PCR儀所提供的激發(fā)和檢測波長的制約，所以這里介紹一下臨床應用中主流機型所提供的檢測波長，見下表。 GeneAmp 5700SDS ABI Prism7700(適用于科研) LightCycler 檢測波長 530nm 500-660nm 530nm;640nm;705nm 三.TaqMan Probes技術要點TaqMan Probes技術要求所用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶不但要具有53外切酶活

7、性,而且要求所獲得的擴增曲線符合PCR反應動力學。Matthew J.Longley等（1990）研究了熱穩(wěn)定DNA聚合酶的53外切酶活性,認為：（）其53外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段；（）53外切酶活性依賴于雙鏈DNA（如右圖）；（）53外切酶活性具有熱穩(wěn)定性，之所以70較50活性低（如右圖）是由于高溫破壞了探針與模板間的雙鏈結構。K-A.Kreuzer等（2000）研究了15種熱穩(wěn)定DNA聚合酶（商品）的53外切酶活性，其中7種聲稱具有53外切酶活性，右圖是這種酶的定量PCR反應（TaqMan）曲線,其中部分酶沒有53外切酶活性、部分酶具有較弱的53外切酶活性、只有一種酶的擴增

8、曲線（A）符合PCR反應動力學。下表列出了部分文獻報道的TaqMan Probes技術所使用的酶和其它相關參數。 Target P1 P2 Probe Enzyme 退火溫度 延伸溫度 HCV 19 25 27 AmpliTaq DNA polymerase 60 60 HIV 19 22 32 AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer) 60 60 Albumin 22 22 26 AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer) 65 65 16S rRNA 27 26 28 Taq DNA polymerase 62 62 g

9、B gene 18 18 27 AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer) 58 58 omlA 22 22 21 AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer) 62 62 lytA 21 21 25 Taq DNA polymerase 60 60 四.Hybridization Probes技術要點Hybridization探針技術要求所用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶沒有53外切酶活性,以保證探針有恒定的濃度并能反復與模板雜交。Jochen,Wilhelm等（2001）研究了Taq酶53外切酶活性對基于Hybridization

10、探針技術的定量PCR的影響，認為：（）Taq酶53外切酶活性降解了部分探針；（）Taq酶的stoffel片段（去除N端289個氨基酸）不具有53外切酶活性，其在高濃度Mg2+存在下，能獲得較好的PCR動力學曲線（如下圖）；（）stoffel片段因高Mg2+濃度造成的非特異性擴增可采用加入TaqStart antibody的方式消除。五.TaqMan探針與Hybridization探針技術的比較1. Hybridization探針技術的特異性高于TaqMan探針，因其信號的產生依賴于兩個獨立探針的特異性。但其在探針設計上需要更多的可選序列；2. TaqMan探針技術的開放性優(yōu)于Hybridization探針技術，原因有二：（）TaqMan探針技術的熒光標記系統(tǒng)是開放的，易從第三方獲得，而Hybridization探針的熒光染料為羅氏專有，易受其控制；（）TaqMan探針和Hybridization探針分別在ABI Prism7700和羅氏LightCycler上建立，因熒光標記和儀器檢測波長的不同，限制了其在兩種儀器上的通用性，目前已有文獻報道將TaqMan探針用在LightCycler上，但未見報道Hybridization探針用在ABI Prism7700上，可能是AB