外周血循環(huán)中肺癌細胞的流式細胞儀定量分析

1、    外周血循環(huán)中肺癌細胞的流式細胞儀定量分析        摘要：目的運用流式細胞儀定量分析外周血循環(huán)中肺癌細胞。方法外周血經(jīng)Ficoll梯度離心分離單核細胞組分，后者用CD45、細胞角蛋白(CK)及肺癌特異性單抗(2F7/S5A)染色后，應用流式細胞儀檢測CD45-CK+2F7/S5A+細胞。然后計算每升血中上述細胞含量。結果(1)外周血單核細胞的表型為CD45+CK-2F7/S5A-，而小細胞和非小細胞肺癌細胞系均為CD45-CK+2F7/S5A+。因此，應用此方法能

2、從106白細胞中檢測到1個肺癌細胞，敏感性達到每毫升血中檢測到5個肺癌細胞；(2)15例正常人及7例肺部良性疾患外周血中CD45-CK+2F7/S5A+細胞均為陰性，而40例肺癌患者外周血14例發(fā)現(xiàn)陽性細胞，陽性率達35 %，陽性細胞含量平均為1×105/L。結論本方法具有較好的敏感性和特異性，能夠定量分析外周血中的微量肺癌細胞。關鍵詞：肺癌細胞；外周血；流式細胞儀；定量分析中分類號：R734.2文獻標識碼：A文章編號：1000-7431(2000)01-0031-04QUANTITATIVE ANALYSIS OF CIRCULATING LUNG CANCERCELLS IN T

3、HE PERIPHERAL BLOOD BY FLOW CYTOMETRYDONG Qiang-gang（Shanghai Institute of Thoracic Tumors,Shanghai Chest Hospital ,Shanghai 200030,China）JIANG Xiao-feng（Shanghai Institute of Thoracic Tumors,Shanghai Chest Hospital ,Shanghai 200030,China）SHA Hui-fang（Shanghai Institute of Thoracic Tumors,Shanghai C

4、hest Hospital ,Shanghai 200030,China）Abstract：ObjectiveTo analyse circulating lung cancer cells in the peripheral blood by flow cytometry.MethodsThe monocyte fraction in the peripheral blood was isolated by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation.The cells obtained were labeled with antibodies agains

5、t CD45,cytokeratin (CK) and antigen (2F7/S5A)expressed on lung cancer cells. The CD45-CK+2F7/S5A+ cells were analyzed by flow cytometry and their concentration per liter of blood was calculated.Results(1) The phenotype of blood monocytes was CD45+CK-2F7/S5A-，while that of small-cell and non-small-ce

6、ll lung cancer cells was CD45-CK+2F7/S5A+。Therefore,using this method one lung cancer cell can be detected in one million of white blood cells,with sensitivity of 5 cancer cells per milliliter of blood.(2)The CD45-CK+2F7/S5A+ cells were detected in none of 15 healthy objectives nor 7 patients with b

7、enign pulmonary diseases.Meanwhile,fourteen cases out of 40 lung cancer patients(35 %) were found to have cancer cells in the peripheral blood,with the concentration of 105 cancer cells/L blood.ConclusionThe method described herein has a good sensitivity and specificity for detection of lung cancer

8、cells in the peripheral blood.Key words：Lung cancer cells；Peripheral blood；Flow cytometry；Quantitative analysis近年來大量研究指出，實體腫瘤(包括肺癌)患者的外周血中存在癌細胞。這些循環(huán)的癌細胞(Circulating Cancer Cells)可能是導致腫瘤廣泛播散的重要原因，隨訪觀察揭示，血循環(huán)中癌細胞陽性患者的生存期較短、預后顯著較癌細胞陰性患者差。因此，檢測血循環(huán)中的癌細胞不僅有助于正確的臨床分期和療效判斷，而且對及時的抗轉移治療和改善患者預后也具有重要的應用價值。血循環(huán)中癌細

9、胞的含量甚微，因而要求檢測方法的敏感性高(通常需要從105白細胞中檢測到一個癌細胞)和特異性好3。此外，最好能為臨床提供定量的分析報告，如每升血中癌細胞的數(shù)量。迄今為止，能同時滿足上述要求的檢測方法尚不多見。本文應用流式細胞儀(Flow Cytometry,FCM)分析技術，以白細胞共同抗原CD45、上皮細胞標志細胞角蛋白(Cytokeratin，CK)和肺癌特異性單抗為指標，建立了一種外周血肺癌細胞的定量分析方法?，F(xiàn)報道如下。材料與方法1.抗體FITC標記的小鼠同型IgG、抗人CD33單抗、CD45單抗和PE標記的小鼠同型IgG、抗人CD45RO單抗、CD53單抗、以及PE標記的Strep-

10、avidin(PE-SVA)購自美國PharMingen公司。FITC標記的抗人Pan-cytokeratin單抗、PE-CY5(PC5)標記的小鼠同型IgG、抗人CD45單抗購自法國Immunotech公司。 生物素化抗人小細胞肺癌單抗2F7和肺腺鱗癌單抗S5A10-2由上海腫瘤研究所制備4，5。2.細胞系小細胞肺癌細胞系NCI-H446和肺腺癌細胞系A549購自中科院上海細胞所。肺腺癌細胞系SPC-A1和大細胞肺癌細胞系SPC-L1由上海市胸部研究所建系。所有細胞均培養(yǎng)在含10 %胎牛血清(FCS，美國Hyclone公司產(chǎn)品)的RPMI 1640培養(yǎng)液(美國GIBCO BRL公司產(chǎn)品)中傳

11、代培養(yǎng)。3.病例選擇1999年45月間在本院收治的肺部疾患47例，年齡為3680歲，平均60歲。入選患者中40例經(jīng)細胞學或病理學證實為非小細胞肺癌，其中22例接受外科手術治療，18例接受化療。7例為肺部良性疾患，包括氣胸3例，肺結核伴胸水3例，肺源性心臟病1例。正常人15例均為上海市胸部腫瘤研究所工作人員。4.標本采集及處理非手術患者抽取5 ml外周血，肝素抗凝；手術患者在術中結扎肺靜脈后，在近端肺靜脈中抽取5 ml血，肝素抗凝。血樣經(jīng)Ficoll分離液(本所自配)離心2 300 rpm 30 min后收集界面細胞，用生理鹽水洗滌1次，重懸于1 ml磷酸緩沖液(PBS，內含0.01 % NaN

12、3和20 % FCS)中，采樣經(jīng)血細胞計數(shù)儀計數(shù)，記錄白細胞數(shù)(LKC，單位：106/ml)。其中5例患者在術后取肺癌組織制成單細胞懸液，按上述方法離心處理。5.抗體標記取12×106細胞，離心后重懸于0.1 ml PBS中，加入20 l PC5-CD45和10 l生物素化2F7/S5A抗體(0.2 mg/ml)，20 溫育10 min，加入10 l PE-SVA繼續(xù)溫育20 min。生理鹽水離心洗滌后，細胞經(jīng)IntraPrep A液(法國Immunotech公司)4固定過夜。次日用生理鹽水離心洗滌細胞1次，用IntraPrep B液通透5 min后，加入20 l FITC-CK抗體

13、20標記30 min，生理鹽水離心洗滌2次，上機分析。6.流式細胞儀(FCM)分析標記樣本經(jīng)EPICS-XL流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司產(chǎn)品)分析，參照國際血液治療和移植工程協(xié)會(ISHAGE)推薦的方法分析CD45- CK+ 2F7/S5A+細胞6。簡述如下：(1)以側向散射(SS)對CD45-PC5作二維散點，設A門；(2)取A門細胞，以SS對CK-FITC作二維散點，選擇CK+細胞設B門；(3)取B門細胞，以SS對CD45-PC5作二維散點，選擇CD45-細胞設C門；(4)取C門細胞，以SS對2F7/S5A-PE作二維散點，選擇2F7/S5A+細胞設D門；(5)分別

14、記錄A門和D門內細胞數(shù)。各階段均以同型抗體染色作為陰性對照。結果正常人外周血經(jīng)Ficoll梯度離心后回收率(即從Ficoll界面收集的細胞數(shù)與白細胞總數(shù)的比值)約為10 %，此類細胞主要是單核細胞，F(xiàn)CM分析(見1)證實其表達單核細胞相關抗原CD33(陽性率90 %)和CD45RO(陽性率86 %)，以及白細胞共同抗原CD45(陽性率100 %)和CD53(陽性率80 %)。但這些細胞不表達肺癌特異性單抗2F7和S5A所識別的抗原，也不被CK特異性單抗染色(見2)。1外周血單核細胞的表型分析正常人外周血經(jīng)Ficoll離心收集單核細胞，然后分別用熒光素標記抗體染色，F(xiàn)CM分析。2單核細胞和肺癌細

15、胞的表型分析Ficoll分離的單核細胞(PBMC)、小細胞肺癌細胞系NCI-H446和大細胞肺癌細胞系SPC-L1分別用FITC-CD45、FITC-CK和2F7/S5A-PE標記及同型對照抗體染色(略)，F(xiàn)CM分析。四系肺癌細胞在相同的Ficoll分離條件下，回收率均高于95 %，2顯示二個肺癌細胞系經(jīng)抗CK和2F7/S5A單抗染色后，陽性率均在97 %以上，但CD45抗體染色陰性。因此，將CD45(PE-CY5標記)、CK(FITC標記)和生物素化2F7/S5A(SAV-PE標記)單抗組合，能夠特異性地區(qū)別白細胞和肺癌細胞。3顯示，正常人白細胞經(jīng)抗體染色標記并經(jīng)FCM序貫設門(Gating

16、)后，不能檢測到CD45- CK+ 2F7/S5A+細胞(見3A)；而小細胞肺癌細胞系NCI-H446經(jīng)過同樣分析，90 %以上為CD45- CK+ 2F7/S5A+細胞(見3B)，用非小細胞肺癌細胞系如SPC-L1、SPC-A1和A549進行分析也獲得相同結果。此外，從非小細胞肺癌手術標本分離的細胞中，也可以清楚地分辨出癌細胞和浸潤的白細胞，CD45- CK+ 2F7/S5A+細胞比例達到47.7%(見3C)，表明不僅肺癌細胞系，而且腫瘤組織中的肺癌細胞均表達CK和2F7/S5A所識別的抗原。3外周血中肺癌細胞的FCM分析外周血PBMC(A)、NCI-H446細胞(B)、非小細胞肺癌手術標本

17、(C)和PBMC：SPC-A1(1041)混合細胞(D)分別經(jīng)PC5-CD45，2F7/S5A-PE和CK-FITC染色，F(xiàn)CM分析，見材料與方法。將非小細胞肺癌細胞SPC-A1按不同比例加入外周血中，然后檢測其中的癌細胞含量，3D結果表明，應用本方法可以將白細胞與混雜的肺癌細胞區(qū)分開來。表1結果顯示此方法能檢測的肺癌細胞最低頻率約為10-6，相當于1 ml外周血中存在5個肺癌細胞，但此時的檢出值約為摻入值的1倍，提示所得結果尚存在一定誤差。然而，在10-510-3頻率范圍內，檢出的癌細胞數(shù)與摻入的癌細胞數(shù)基本一致。表1外周血中肺癌細胞檢測的敏感性評估癌細胞頻率癌細胞數(shù)量摻入量檢出量00010

18、-6255810-525022810-42500295210-325000251375 ml外周血中摻入指定數(shù)量的肺癌細胞后，分離PBMC并用熒光素標記抗體染色和FCM分析，計算檢出的癌細胞數(shù)量，詳見材料與方法。 進一步檢測15例正常人、7例肺部良性疾患和40例肺癌外周血，發(fā)現(xiàn)正常人外周血中CD45- CK+ 2F7/S5A+細胞最高值為22/5萬細胞，而肺部良性疾患者外周血中上述細胞量為25/5萬細胞，因此，若按平均值±2個標準差(即30/5萬細胞)作為正常值，則正常人和肺部良性疾患均為陰性，而35 %(14例/40例)肺癌患者外周血可檢測到癌細胞，其含量從0.01×10

19、6/L至0.18×106/L不等，平均為0.10±0.06，即每升血中含十萬肺癌細胞(見表2)。此外，22例外科手術的肺癌患者之肺靜脈血中，9例(41%)發(fā)現(xiàn)肺癌細胞，陽性率明顯高于非手術患者的外周血(5/18例，28%)。表2外周血肺癌細胞的流式細胞儀分析血標本來源例數(shù)CD45- CK+ 2F7/S5A+細胞陽性率陽性細胞數(shù)正常人1500肺部良性疾患700肺癌患者4035%0.10±0.08其中：術中肺靜脈血2241%0.10±0.05非手術病人外周血1828%0.09±0.05討論 檢測腫瘤患者外周血循環(huán)中的癌細胞是目前頗受關注的一項診斷新

20、技術，具有廣泛的臨床應用價值。但其可信度如何主要取決于檢測方法的敏感性和特異性。一般認為，外周血中癌細胞含量甚微，但由于缺乏定量分析方法，尚難以估計血液中癌細胞含量的確切數(shù)據(jù)。對這些細胞目前多采用Rt-PCR進行分析(敏感性約為從105106白細胞中發(fā)現(xiàn)1個癌細胞)，主要的觀察指標是PBMC中存在細胞角蛋白(CK)mRNA。但也有若干FCM的研究報道711。然而，以CK單一指標作為判斷存在癌細胞的標準，會產(chǎn)生假陽性結果，因為正常白細胞也表達某些CK(如CK-19) mRNA。將白細胞共同抗原CD45與CK組合，采用FCM方法可以排除大部分假陽性細胞(即CD45+CK+細胞)，但無法區(qū)分血液中的

21、良性和惡性上皮細胞(均為CD45-CK+細胞)。也就是特異性問題還沒有得到解決。解決上述問題的理想途徑是在CD45/CK組合的基礎上，增加一項腫瘤特異性指標。但迄今為止，只有在前列腺癌等少數(shù)腫瘤中能做到這一點，如前列腺癌細胞表達前列腺特異性抗原PSA。本文試建立一種外周血肺癌細胞的定量檢測技術。實驗結果達到了預期目的，證明應用本方法最低可以從106血細胞中發(fā)現(xiàn)一個肺癌細胞。主要有二點，一是利用癌細胞和正常血細胞的密度差異，通過簡單的Ficoll梯度離心去除了90 %以上的白細胞(如淋巴細胞和粒細胞)，使敏感性提高了一個數(shù)量級。二是將外周血CD34+造血干細胞定量檢測技術移植到本系統(tǒng)中，進一步排

22、除了假陽性干擾并獲得定量的分析結果。國際血液治療和移植工程協(xié)會(ISHAGE)推薦用序貫設門(Gating)方法排除假陽性細胞。據(jù)此可從外周血白細胞中找出0.01 %量的CD34+細胞，并能計算出總的CD34+細胞數(shù)量。本文將該方法的原理應用到外周血肺癌細胞的檢測之中，并增加特異性單抗標記，使之能選擇性識別肺癌細胞，其結果是可信的。應用上述方法分別分析了正常人、肺部良性疾患和肺癌病人的外周血標本，初步結果提示，35 %肺癌患者血液中存在癌細胞，此數(shù)值與臺灣學者最近的報道吻合。此外，41 %肺癌患者在術中阻斷血流后，其近端肺靜脈中出現(xiàn)肺癌細胞，提示這些患者在接受外科手術后體內出現(xiàn)微量癌細胞播散，

23、其含量約為1×106/L。這些微量癌細胞播散可能是術后腫瘤復發(fā)轉移的重要原因。綜上所述，本文報道了一種敏感性高、特異性好的外周血肺癌細胞定量分析方法。應用本方法能夠區(qū)分外周血中的正常白細胞和肺癌細胞，發(fā)現(xiàn)35 %肺癌患者的外周血中存在癌細胞。初步結果提示，應用本方法有可能早期發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的血源性播散，為有效控制腫瘤復發(fā)轉移創(chuàng)造條件。但本方法的臨床價值尚需進行大量深入的研究才能確認。基金項目：獲上海市醫(yī)學發(fā)展基金重點項目資助作者簡介：董強剛，男，博士，副教授，碩士導師。作者單位：董強剛（上海市胸科醫(yī)院、上海市胸部腫瘤研究所，上海，200030）江曉豐（上海市胸科醫(yī)院、上海市胸部腫瘤研究

24、所，上海，200030）沙慧芳（上海市胸科醫(yī)院、上海市胸部腫瘤研究所，上海，200030）李魯萍（上海市胸科醫(yī)院、上海市胸部腫瘤研究所，上海，200030）喬生軍（上海市腫瘤研究所）許凱黎（上海市腫瘤研究所）參考文獻：1Peek K, Sher YP,Shih JY, et al. Detection and quantitation of circulating cancer cells in the peripheral blood of lung cancer patientsJ.Cancer Res,1998,58(13):27612Yeh KH,Chen YC,Yeh SH, et

25、al. Detection of circulating cancer cells by nested reverse transcription-polymerase chain reaction of cytokeratin-19(CK19)possible clinical significance in advanced gastric cancerJ. Anticancer Res,1998,18(2B):12833Funaki NO,Tanaka J,Ohshio G, et al. Cytokeratin 20 mRNA in peripheral venous blood of

26、 colorectal carcinoma patientsJ. Br J Cancer,1998,77(8):13274張瑞鑒，李斯德.三株肺癌單抗混合血清測肺癌的價值J.腫瘤，1997，17(5)：2815洪錦心，張欣，魏明輝，等.抗原分子量50-kD和40-kD的人體小細胞肺癌單克隆抗體J.腫瘤，1986，6(6)：2486Gratama JW,Orfao A,Barnett D, et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cellsJ. Cytometry,1998,34:1287Simpson SJ,Vachula M,Kennedy MJ, et al. Detection of tumor cells in the bone marrow,peripheral blood,and apheresis products of breast cancer patients using flow cytometryJ. Exp Hematol,1995,23(10):10628Planz B,Szyska P,Valdor M, et al. Detection of circulating prostatic cells during radical