實時定量大腸癌組織中MK基因表達及其臨床意義

1、作者：李克強 陳功星 張佳煒 曹樹立 胡錫浩 【摘要】目的 利用實時定量PCR（Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）相對定量大腸癌組織中Midkine基因的表達，探討MK基因在大腸癌不同病理狀態(tài)中的意義。方法 提取34例臨床大腸癌組織及其癌旁正常組織中的總RNA，經(jīng)寡聚脫氧胸腺嘧啶逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR擴增，以內(nèi)標(biāo)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的mRNA相對定量MK基因的mRNA表達，比較癌組織與其癌旁正常組織中的MK表達差異。結(jié)果 34例樣本中癌組織較之癌旁正常組織，MK基因表達降低（P0.01）；其中在Du

2、cks分期中C期、女性組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、管狀腺癌和浸潤漿膜層組中癌組織較之癌旁正常組織表達降低（P0.05），其余組大腸癌組織較之癌旁正常組織無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論 在大腸癌病程晚期癌組織中MK基因的表達水平降低。 【關(guān)鍵詞】實時定量 PCR Midkine基因【Abstract】ObjectiveWith Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Midkinegene expression was relatively quantified in colorectal cancer samples. We di

3、scussed a relationship of MK expression and colorectal cancer. MethodsThe total RNA was extracted from 34 clinical samples of colorectal cancerous tissue and their adjacent normal tissue. The RNA was reverse transcripted into cDNA with oligodT. And the cDNA was amplified by RT-PCR. MK relative expre

4、ssion was quantified to an inherence gene Glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH). At last the different was analyzed between colorectal cancerous tissue and their adjacent normal tissue. ResultIn the 34 samples MK mRNA of the colorectal cancerous tissue is less than that of the adjacent normal tissue (P

5、0.01). And the same situation is MK mRNA in the14 C-phase samples, the female, the transferred lymphaden, the tubular adenocarcinoma and the invasive subserous groups (P0.05). But there is no statistical signification （P0.05）in the other groups. ConclusionMK expresses lowly in the colorectal cancer

6、of late stage. 【Key words】Real-time QuantitativePCRMidkine gene 大腸癌在我國近幾年發(fā)病率上升，5年生存率在60左右，但治療效果30年來無顯著提高1。大腸癌發(fā)生機制相對于其它腫瘤的發(fā)生機制來說較為清楚，但仍有很多問題尚未解決，特別是早期發(fā)生階段的機制還不清楚,應(yīng)用基因分析手段檢測相關(guān)基因的異常變化有可能在早期診斷和預(yù)后判斷上發(fā)揮作用2。Midkine（MK）基因是日本學(xué)者Kadomatsu等3運用差異雜交的方法，從視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎腫瘤HM-1細(xì)胞株cDNA文庫中篩選出的一個新基因，在多種腫瘤患者血清中高表達4，尤其是在肝癌組織中

7、的表達，肝癌組織惡化時表達增加，肝癌組織惡性程度低時表達少5，此外，MK基因在早期大腸癌變組織中也是表達升高的6，但晚期的表達未見報道，作者自2006年5月至2007年12月利用實時定量PCR（RT-PCR）技術(shù)，對臨床大腸癌樣本進行分析，觀察MK基因在大腸癌組織及其癌旁正常組織中的表達情況，進一步探討MK基因表達mRNA水平與大腸癌病理過程的關(guān)系。 1材料和方法 1.1樣本的采集34例大腸癌及其癌旁正常組織標(biāo)本隨機取自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤外科、普通外科手術(shù)患者，其中男17例，女17例；年齡2584歲，平均62.1歲，經(jīng)病理檢查確定。 1.2試劑和儀器引物設(shè)計為跨目的基因內(nèi)含子、含兩

8、個外顯子部分堿基的序列，并經(jīng)blastn基因庫搜索，符合引物常規(guī)設(shè)計要求，熒光素標(biāo)記為PCR儀器所要求：MK基因上游引物：5-GCGCGCTACAATGCTCAGT-3，下游引物：5- CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT-3，探針：5-FAM CCAGGAGACCATCCGCGTCACC TRMAR-3（上海生物工程公司合成），含甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因上、下游引物和VIC標(biāo)記探針的20Human GAPDH、2PCR master mix、dNTPs購于PE公司。Trizol、5Strand buffer、0.1M DTT、SSTR為GIBCO產(chǎn)品，OligodT由上海

9、生物工程公司合成。主要設(shè)備RTPCR反應(yīng)儀7700 Sequence Detector ABI PRISM(PE公司)。 1.3總RNA提取分別取手術(shù)后離體大腸癌組織、癌旁正常組織各約100mg，在液氮環(huán)境下?lián)v碎并研磨成粉，迅速置于1.5ml的eppendorf 管中，加1ml的Trizol液，反復(fù)吹打約10min，加0.2ml氯仿，用力振蕩混勻，冰浴10min后, 低溫12000g離心15min，吸取上清液置另一eppendorf 管中，加0.5ml異丙醇混勻，室溫沉淀10min， 12000g離心10min, 棄上清液,沉淀加75%乙醇1ml洗滌1次，待酒精揮發(fā)干后溶于適量0.1%的焦碳酸

10、二乙酯(DEPC)水中，-20保藏備用。 1.4逆轉(zhuǎn)錄cDNA取10l的RNA，加入1l的50M OligodT，70變性10min，立即置冰上2min，離心。然后加入9l混合試劑：4l 5Strand bufer、2l 0.1M DTT、1l dN(A,T,C,G)TP、1l RNase inhibitor、0.5l SSTR2、0.5l 1%的DEPC水，在42水浴52min，然后70水浴15min終止反應(yīng)，加80l水混勻置-20冰箱保存。 1.5RT-PCR50l反應(yīng)體系中分別含有MK基因上、下游引物各0.3M、探針0.2M；2.5l 20Human GAPDH、25l 2PCR mas

11、ter mix、10l cDNA。然后在定量PCR反應(yīng)儀上進行檢測，反應(yīng)條件為：50預(yù)變性2min；95變性10min；95變性30s；60退火1min，擴增40個循環(huán)。在指數(shù)期內(nèi)采集，根據(jù)儀器使用指南及實際情況，設(shè)定參數(shù)值，得到每個PCR反應(yīng)的CT（Cycle Threshold）值，即模板cDNA經(jīng)PCR擴增達到某一熒光強度的循環(huán)次數(shù)。 1.6統(tǒng)計學(xué)分析MK表達的mRNA是以同一組織中內(nèi)標(biāo)GAPDH的表達為標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻7進行數(shù)據(jù)的計算轉(zhuǎn)換，得到的相對GAPDH校正值，一式三份用均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差（xSD）表示，根據(jù)樣本來源，及臨床患者不同生理病理特征，參照相關(guān)文獻報道8分別列成6個大組，又在每

12、組中再分成不同特征的小組，對癌組織和癌旁組織之間，用SPSS(13.0版)軟件進行處理，統(tǒng)計學(xué)分析使用t檢驗。 計算公式： cDNAMK2CTMKcDNAGAPDH2CT GAPDH cDNAMKcDNAGAPDH2CT(CT =CT GAPDHCT MK) cDNAMK表示MK基因的cDNA量，cDNAGAPDH表示GAPDH基因的cDNA量，CT GAPDH（或CT GAPDH）以及CT MK（或CT MK）表示cDNA經(jīng)PCR擴增到指數(shù)期時一定量的理想循環(huán)數(shù)。 2結(jié)果 本實驗中實時定量PCR（RT-PCR）檢測的基因，是電腦監(jiān)控下的每個樣本基因DNA逐步倍增變化的整個過程（圖1），以每次

13、PCR循環(huán)結(jié)束后熒光的強度代表基因的產(chǎn)量，在圖中為曲線鏈接的點，每種基因在一個圖中顯示，每條曲線代表一個樣本中檢測基因DNA在整個PCR過程中倍增量的變化，樣本中基因DNA含量以在圖中的位置表現(xiàn)，樣本基因DNA含量越少，曲線逐漸右移。在指 圖1cDNA聚合酶鏈反應(yīng)倍增全過程 注：、B分別為樣本中GAPDH基因與MK基因表達mRNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA聚合酶鏈反應(yīng)倍增全過程。橫軸為Cycle，即PCR循環(huán)數(shù)，每一單位表示一次PCR循環(huán)，縱軸為熒光強度的對數(shù)值（n），即每次PCR循環(huán)后當(dāng)時的所有熒光強度與本底的差值，每一條曲線表示一個樣本中單一基因PCR反應(yīng)的全過程，整個曲線變化與普通PCR變化過程相

14、同，有三個區(qū)域，依次為基數(shù)期、指數(shù)期和平臺期。 表1大腸癌組織及其癌旁正常組織中MK基因表達的mRNA 組別nmRNA水平(xSD)癌組織癌旁正常組織P值年齡（歲） 4040.060.040.330.220.10 4164100.110.20.210.190.13 65200.120.160.210.180.07性別 男170.150.210.20.180.40 女170.060.090.250.190.00病理類型 乳頭狀腺瘤50.150.260.260.170.44 管狀腺癌200.130.170.240.20.02 黏液腺癌30.050.060.180.230.48 其它類型50.040

15、.020.150.150.15 混合型10.010.07淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性180.120.170.210.190.06 陽性160.10.160.240.190.02浸潤程度 黏膜下層10.040.27 肌層90.240.260.30.220.57 漿膜層240.060.080.190.170.00Ducks分期 A40.180.270.30.150.41 B140.10.140.180.20.11 C140.090.160.250.190.02 D20.150.210.150.21合計340.110.160.220.190.00 注：P值為該組癌組織與癌旁正常組織兩類樣本中MK表達mRNA水平

16、的t檢驗，混合型是指病理觀察中同時存在2種或2種病理類型的癌組織 數(shù)期內(nèi)采集原始數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正，每個樣本中癌組織及其癌旁組織相對定量MK的表達的mRNA水平，根據(jù)樣本來源的不同生理病理特征分組（表1）。年齡組中分為青、中、老三小組，癌組織較之癌旁正常組織中MK表達無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；病理類型中管狀腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性及Dukes分期中C期中MK表達，癌組織低于其癌旁正常組織（P0.05）；而性別中女性患者組、腫瘤浸潤至漿膜層組及總體樣本中，癌組織明顯低于其癌旁正常組織MK表達（P0.01）。此外，由于樣本收集的不足，病理類型中的混合類型、浸潤黏膜層和與Dukes分期D期不能進行統(tǒng)計學(xué)分

17、析。其余組中癌組織較之癌旁正常組織中的MK表達值均無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。 3討論 實時定量PCR（RT-PCR），通過測試mRNA逆轉(zhuǎn)錄后cDNA的含量，從而定量分析基因表達情況，其高通量、簡捷在基因研究與應(yīng)用的許多方面具有重要作用9，也是臨床診斷分析的一個手段。由于實時定量PCR的直觀效果，檢測者可直接監(jiān)控檢測過程的全過程（圖1），避開PCR反映過程中表現(xiàn)不合實際的基數(shù)期和平臺期，及由于儀器設(shè)備客觀原因出現(xiàn)的錯誤，從指數(shù)期中采集到理想數(shù)據(jù)。RT-PCR使用的參照標(biāo)準(zhǔn)有外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)2種，作者是以同一樣本中的GAPDH為內(nèi)標(biāo)，在同一反應(yīng)管中同時檢測目的基因和內(nèi)標(biāo)基因的表達，以此內(nèi)標(biāo)相對定量本

18、樣本中目的基因MK的表達，客觀又簡便。此外，本組樣本，每個患者均同時采集癌組織及其癌旁正常組織，檢測兩份樣本，統(tǒng)計分析的是同一患者樣本中癌組織與其癌旁正常組織中MK基因的表達，可客觀反映異常組織基因表達的實際情況。使用該方法，分析了34例大腸癌臨床樣本癌組織及其癌旁正常組織MK基因的表達，從收集的樣本分布看（表1），在Dukes分期組中大部分是B、C期，加上D期的2例，中、晚期樣本占大多數(shù)，這符合中國的國情，中國患者早期預(yù)防不充分，至出現(xiàn)不適癥狀后就醫(yī)，大多數(shù)患者已至中、晚期，臨床上隨機收集的樣本也體現(xiàn)了這一特色。本研究表明總體樣本癌組織較與癌旁正常組織中的MK表達水平降低（P0.01），這與

19、Ye等6報道的MK表達情況不一致，該文分析了20例大腸癌前期病變的腺瘤組織中，MK基因表達升高。本資料34例樣本不同生理病理分組體現(xiàn)早期特征的樣本中，病理分類組中乳頭狀腺瘤5例，浸潤程度組中黏膜下層1例，Ducks分期組中A期4例，均占總體樣本的少部分，其中可統(tǒng)計分析的小組中，癌組織較之癌旁正常組織無顯著性差異（P0.05）,推測可能由于樣本數(shù)量的原因，尚須進一步加大樣本量進行分析來反映國人這方面的情況。但不同病理特征分組中體現(xiàn)大腸癌晚期癌特征的小組樣本，占總體樣本的大部分，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽性、浸潤程度組中深層組織漿膜層及Dukes分期組中C期等小組樣本中，MK基因的表達癌組織較為癌旁正常

20、組織降低（P0.05），與總體樣本反應(yīng)的結(jié)果一致，表明大腸癌晚期的MK基因表達是降低的，這為大腸癌的臨床診治和研究提供參考。至于MK基因表達在女性組中的差異（P0.01），尚待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1 鄭樹.大腸癌防治現(xiàn)場研究.中國腫瘤,2005,l4(6):352354.2 殿春.大腸癌分子生物學(xué)研究進展.中國實用內(nèi)科雜志，2006.26(24)：9241927.3 Kadomatsu K, Tomomura M, Muramatsu T. cDNA cloning and sequencing of a new gene intensity expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in mid-gestation period of mouse embryogenesis. Biochem Biophys Res Commun, 1988,151:13121318.4 Ikematsu S, Yano A, Aridome K,