銀屑病患者中CXC型趨化因子受體CXCR2 mRNA 的表達(dá)

1、銀屑病患者中CXC型趨化因子受體CXCR2 mRNA 的表達(dá)*         楊桂蘭，陳志強(qiáng)，鄭家潤，李新宇，陳 沄，李遇梅，高建明【摘要】  目的  測定CXC型趨化因子受體CXCR2 mRNA在銀屑病患者中的表達(dá)情況，弄清該受體在銀屑病患者中的病理生理狀態(tài)，探討其在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。方法  應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測33例進(jìn)行期斑塊型銀屑病患者治療前皮損部位、皮損周圍外觀正常皮膚和外周血中性粒細(xì)胞、單一核細(xì)胞及其中16例治療至皮損消退70以上的患者外周血中

2、性粒細(xì)胞與單一核細(xì)胞中CXCR2 mRNA的表達(dá)水平，并設(shè)30例健康人為對照組。將檢測結(jié)果與銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）及外周血中性粒細(xì)胞、單一核細(xì)胞中該受體的表達(dá)水平與皮損部位表達(dá)水平之間分別進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果  銀屑病患者皮損部位表皮與真皮中CXCR2 mRNA表達(dá)水平分別為1.85±0.76和1.23±0.48，明顯高于皮損周圍外觀正常皮膚表皮及真皮(分別為0.63±0.48和0.86±0.39；分別P0.001，P0.01)，及健康對照者皮膚表皮及真皮（分別為0.59±0.21和0.55±0.48，P

3、均0.001)，且均與PASI呈顯著正相關(guān)（表皮：r=0.86，P0.001; 真皮：r=0.38，P0.05）。銀屑病患者外周血中性粒細(xì)胞中CXCR2 mRNA表達(dá)水平為1.45±0.87，明顯高于健康對照及治療后患者（分別為0.74±0.58，P0.001； 0.63±0.58，P0.01），并與PASI呈顯著正相關(guān)（r=0.84，P0.001）。銀屑病患者外周血單一核白細(xì)胞中CXCR2 mRNA的表達(dá)水平為1.38±0.87，明顯高于健康對照組（0.73±0.58，P0.001)。銀屑病患者皮損部位表皮中CXCR2 mRNA的表達(dá)水平與外

4、周血中性粒細(xì)胞中該受體的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.61，P0.001）； 銀屑病患者皮損部位真皮中CXCR2 mRNA的表達(dá)水平與外周血單一核白細(xì)胞中的該受體的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.64，P0.001）。結(jié)論  CXCR2在銀屑病患者中的表達(dá)均異常增高，可能參與了銀屑病的發(fā)病機(jī)制。      【關(guān)鍵詞】  銀屑?。皇荏w；趨化因子    【Abstract】  Objective  To investigate the expression levels of chemok

5、ine receptors CXCR2 in progressive plaque psoriasis and their clinical significance.Methods  Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) technique was applied to semi-quantitatively analyze CXCR2 mRNA expression levels in epidermis and dermis from lesion and peri-lesion skin，Periphe

6、ral Blood polymorphonuclears(PMN)and peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in each of 33 cases of psoriatic patients before treatment and PMN and PBMC in16 cases from the 33 patients treated until the skin lesions remission about 70% and 30 healthy controls.The correlations between CXCR2 mRNA val

7、ues and psoriatic area and severity index (PASI)，and between the CXCR2 mRNA values in PBMC and PMN and in leision dermis and epidermis were evaluated，respectively.Results  （1）The CXCR2 mRNA levels in lesion epidermis and dermis in psoriatic patients were 1.85±0.76 and 1.23±0.48，respec

8、tively，which were markedly higher than those in peri-lesion epidermis and dermis（0.63±0.48 and 0.86±0.39，respectively，P0.001，P0.01，respectively) and normal epidermis and dermis（0.59±0.21 and 0.55±0.48，respectively，both P0.001).Furthermore，positive correlation were noticed both be

9、tween epidermis CXCR2 mRNA values and PASI (r=0.86，P0.001)，and dermis CXCR2 mRNA values and PASI(r=0.38，P0.05).（2）The CXCR2 mRNA levels in PMN from psoriatic patients were 1.45±0.87，which were markedly higher than those in normal controls and treated patients（0.74±0.58，P0.001 and 0.63±

10、;0.58，P0.01 respectively）. Positive correlation were noticed between CXCR2 mRNA values and PASI（r=0.84，P0.001）.（3） CXCR2 mRNA expression levels in PBMC from psoriatic patients were 1.38±0.87，which were markedly higher than those in normal controls（0.73±0.58，P0.001) but similar with treated

11、 patients(1.21±0.62)，furthermore，the later were also markedly higher than those in normal controls(P0.05).（4）Positive correlation were noticed between the CXCR2 mRNA values in lesion epidermis and inPMN，and in lesional dermis and in PBMC，respectively.Conclusion  The increased expression of

12、 CXCR2 maybe involved in the pathogenesis of progressive plaque psoriasis.       【Key words】  psoriasis；receptor；Chemokine CXCR2      銀屑病是一種慢性炎癥性疾病，病因及發(fā)病機(jī)制至今仍尚未完全明確?，F(xiàn)認(rèn)為銀屑病的發(fā)病主要涉及免疫、炎癥、新血管生成及角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖等四個(gè)方面。趨化因子及其受體系統(tǒng)具有廣泛的生物學(xué)作用，在免疫及炎癥過程中起著重要作用。趨化因子通過趨化因子受體

13、發(fā)揮作用。CXCR2為CXC型趨化因子白介素8（IL-8）及生長相關(guān)癌基因（GRO-）的特異性受體，已有研究顯示銀屑病皮損部位 IL-8 及GRO-增高，為了解趨化因子受體在銀屑病患者中的病理生理狀態(tài)，筆者用RT-PCR法檢測了CXC型趨化因子受體CXCR2在銀屑病患者中的表達(dá)情況。      1  資料與方法        病例選擇  明確診斷的中重度進(jìn)行期斑塊狀銀屑病患者33例，均為2002年312月在我院就診的門診或住院患者，男19例，女14 例，年齡1865歲，平均（34.71

14、±10.26）歲，病程4個(gè)月40年，平均（9.76±7.35）年。用PASI評分法來評估患者的疾病嚴(yán)重程度。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18周歲以上，診斷明確，PASI評分在8.4以上；近3個(gè)月內(nèi)未用過維甲酸制劑、皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑，1個(gè)月內(nèi)未用過治療銀屑病的內(nèi)服及外用藥物，無其他系統(tǒng)性疾病或皮膚疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：近半年內(nèi)服用過皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑或維甲酸制劑；近1個(gè)月內(nèi)服用過口服治療銀屑病或其他系統(tǒng)治療藥物，近1個(gè)月內(nèi)外用過治療銀屑病的藥物；伴有糖尿病、高血壓等其他系統(tǒng)性疾?。换颊呔驮\時(shí)懷孕、哺乳或處于月經(jīng)期。       

15、標(biāo)本收集  對符合上述入選標(biāo)準(zhǔn)的患者詳細(xì)記錄病史資料，然后自肘靜脈取血8ml加入肝素抗凝管備分離白細(xì)胞；接著用8mm角膜環(huán)鉆分別自皮損部位及皮損周圍外觀正常皮膚各鉆取一塊皮膚組織，鉆取深度以達(dá)到真皮全層為宜，用刀片沿皮面平行切下皮膚組織，迅速放入液氮中速凍或直接用0.25%分散酶消化。標(biāo)本收集完畢后根據(jù)患者的病情給予相應(yīng)的抗銀屑病藥物治療，病情較輕者給予口服銀屑沖劑或復(fù)方青黛丸，外用煤焦油凝膠、硫柳軟膏及去炎松霜等，病情較重者給予口服雷公藤、紅霉素及外用煤焦油凝膠、硫柳軟膏及去炎松霜等。上述患者經(jīng)有效治療至皮損消退70%以上時(shí)取療后血，取血前再次對患者進(jìn)行PASI評分，共收集到16例

16、治療后患者。正常對照30例，均來自我院研究生、體檢職工及皮膚外科整形美容的患者，年齡、性別與患者具有可比性。        主要儀器及試劑  XL-70超高速離心機(jī)（BECKMAN），Hema  480基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），TFX-20M紫外檢測儀（Vilber lourmat 法國），CS-9000雙波長飛點(diǎn)薄層掃描儀（日本島津）。Trizol （GIBICO/BRL），Super ScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen），

17、TaqDNA聚合酶（Promega），DNA片段長度標(biāo)準(zhǔn)（上海華美生物工程公司），瓊脂糖（Promega）。        特異性引物  CXCR2  5- CTTTTCTACTAGATGCCGC -3，5-AGATGCTGAGACATATGAATTT -3，擴(kuò)增片段為417bp；-Actin 5-CAACTCCATCA TGAAGTGGTAAC -3，5-CCACACGGAGTACTTGCGCGCCTC-3擴(kuò)增片段為180bp，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。    

18、0;   方法        表真皮分離  用0.25%分散酶消化分離真表皮，分離后的真表皮分別被置入2個(gè)加入Trizol的玻璃研磨器中勻漿備用。        中性粒細(xì)胞與單一核細(xì)胞的分離  將肝素抗凝靜脈血8ml用無鈣、鎂Hank液對倍稀釋，以41的比例向稀釋后的血中加入6%葡聚糖，混勻后37靜置40min，靜置后含上述液體的血液混合物分為兩層，上層清亮液中含有白細(xì)胞。取上層清亮液以32比例沿管壁緩慢加至另一試管中的分層液表面，2000r/min 離心20 mi

19、n，離心后單一核白細(xì)胞位于上層血漿與下層分層液的交界處，中性粒細(xì)胞位于管底，分別將單一核白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞移入干燥試管，各用5倍于細(xì)胞的Hank液洗2次，在顯微鏡下記數(shù)，取2×106個(gè)單一核白細(xì)胞及8×106個(gè)中性粒細(xì)胞加入Trizol備用。        提取RNA  采用Trizol試劑，按說明書操作提取RNA。        反轉(zhuǎn)錄合成cDNA  嚴(yán)格按照Invitrogen的試劑盒說明書進(jìn)行操作。合成cDNA的總體積為20l。具體10mmol/L

20、dNTP mix 1l，Oligo（DT）12-181l，RNA模板8l，65孵育5min，置于冰上至少1min，加入由10×RT 緩沖液2l，25mmol/L MgCl2 4l，0.1mmol/L 二硫蘇醇糖（DTT） 2l，RNA酶抑制劑1l組成的反應(yīng)混合物9l，42孵育2min，加入逆轉(zhuǎn)錄酶1l，42孵育50 min，70孵育15min終止反應(yīng)，置于冰上至少1min，加入RNA酶1l，37孵育20min，去除殘余的RNA，獲得cDNA。        PCR擴(kuò)增  反應(yīng)總體積為25l，包括10×PCR緩沖液2

21、.5l，25mmol/L MgCL2 1.5l，10 mmol/L dNTP mix 0.5l，等量上下游引物混合物1l，相應(yīng)cDNA 1l。擴(kuò)增條件為： 94預(yù)變性5min。94變性33s； 57退火45s，72延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72延伸7min。以-Actin作為內(nèi)參照進(jìn)行半定量。        電泳及照相  用2%瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液用0.5×Tris-硼酸，以每厘米膠長5V的電壓進(jìn)行電泳，1h后在紫外發(fā)射儀上觀察結(jié)果并進(jìn)行近距離攝影。        圖

22、像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  膠片用薄層掃描儀掃描，所有擴(kuò)增產(chǎn)物的掃描峰面積值均以相應(yīng)-Actin為基準(zhǔn)校正后得到擴(kuò)增產(chǎn)物的相對半定量值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 10.0軟件包進(jìn)行處理，采用方差分析法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較。相關(guān)性分析采用Pearson模型。      2  結(jié)果   治療前患者的PASI評分為8.447.2，平均27.26±8.84；所收集到的治療后患者的PASI評分治療前為10.843.2，平均25.61±10.78，治療后為1.215.3，平均5.02±3.90，治療后比

23、治療前平均下降了80.75%。CXCR2 mRNA的表達(dá)情況見表1及圖14。         表1  銀屑病患者中趨化因子受體CXCR 2mRNA表達(dá)水平  （x±s）   注：為銀屑病患者皮損部位(治療前白細(xì)胞)/皮損周圍(治療后白細(xì)胞)與健康人對照比較；為銀屑病患者皮損部位(治療前白細(xì)胞)與皮損周圍(治療后白細(xì)胞)比較   圖1  表皮中CXCR2 mRNA電泳圖      

24、; 圖2  真皮中CXCR2 mRNA電泳圖   圖3  中性粒細(xì)胞中CXCR2電泳圖       圖4  單一核細(xì)胞中CXCR2電泳   所測健康對照標(biāo)本中均存在一定量的CXCR2 mRNA表達(dá)。在銀屑病患者皮損部位表皮及真皮中，CXCR2 mRNA表達(dá)水平均明顯高于健康人對照皮膚及同一組患者皮損邊緣外觀正常皮膚的表皮和真皮，差異均具有非常顯著性（P均0.001），銀屑病皮損周圍外觀正常皮膚真皮表達(dá)CXCR2 mRNA亦高于健康人對照組（P0.01）。以PASI-

25、CXCR2進(jìn)行直線回歸分析，結(jié)果表皮及真皮中CXCR2 mRNA表達(dá)水平與PASI之間均存在明顯正相關(guān)性，分別為：表皮 r=0.86，P0.001；真皮r=0.38，P0.05。      在中性粒細(xì)胞中，治療前銀屑病患者CXCR2 mRNA表達(dá)水平顯著高于健康人對照組（P0.001），并與PASI評分之間均存在正相關(guān)（r=0.84，P0.001）；治療前銀屑病患者CXCR2 mRNA表達(dá)水平也明顯高于治療后患者（P0.01）；治療后患者與健康人對照組相比較差異無顯著性。      在單一核細(xì)胞中，治療前銀屑病患者

26、CXCR2 mRNA表達(dá)水平明顯高于健康人對照組(P0.001)，但與PASI之間無明顯相關(guān)性（ r=0.122，P0.05）。治療后患者仍高于健康人對照組(P0.05)，但同一組患者治療前后相比較差異無顯著性 (P0.05)。      銀屑病患者皮損部位表皮中CXCR2 mRNA的表達(dá)水平與外周血中性粒細(xì)胞中該受體的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.61，P0.001）； 銀屑病患者皮損部位真皮中CXCR2 mRNA的表達(dá)水平與外周血單一核白細(xì)胞中的該受體的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.64，P0.001）。      3

27、  討論      趨化因子是主要使細(xì)胞發(fā)生趨化作用的細(xì)胞因子，它們均具有特征性的同源氨基酸序列，幾乎所有的趨化因子均含有4個(gè)保守的半胱氨酸為其特征，從基因及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上可將趨化因子分成4型，即CXC型（氨基末端的兩個(gè)半胱氨酸之間被另一氨基酸隔開）、CC型（氨基末端的兩個(gè)半胱氨酸相毗鄰）、C型（氨基末端僅有1個(gè)半胱氨酸）及 CX3C型（氨基末端兩個(gè)半胱氨酸之間有3個(gè)氨基酸）。趨化因子通過與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用，相應(yīng)的趨化因子受體也分為CXC、CC、XC及CX3C等4型。在免疫及炎癥反應(yīng)中該系統(tǒng)不僅參與炎癥細(xì)胞的活化、增殖及向炎癥部位的移行，

28、而且通過自分泌及旁分泌途徑參與了免疫調(diào)節(jié)、新血管生成等病理過程，從而對免疫及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)起到重要作用。      表皮中角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖及分化異常是銀屑病的基本病理特征。體外研究顯示IL-8具有刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增生的作用，IL-8需與其特異性受體結(jié)合才能活化角質(zhì)形成細(xì)胞并使之發(fā)生增殖，CXCR2為IL-8的特異性受體。銀屑病患者表皮中存在大量IL-81，培養(yǎng)的銀屑病皮損部位角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-8增加，其上清液對中性粒細(xì)胞的趨化作用較健康人的明顯增強(qiáng)2。筆者用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)健康人表皮中存在少量CXCR2 mRNA的表達(dá)，提示CXCR2可能參與

29、了正常表皮的增生與分化。Kulke 等3的研究結(jié)果表明銀屑病皮損部位角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)CXCR2增高，作者認(rèn)為CXCR2可能參與了銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的活化、增生及分化。      皮損部位中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤也是銀屑病的基本病理特征。銀屑病的主要病理特點(diǎn)之一為皮損部位角質(zhì)層內(nèi)白細(xì)胞浸潤形成Munro微膿腫，這主要是由白細(xì)胞自真皮微乳頭上端毛細(xì)血管向表皮游走所致，這是個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及諸多細(xì)胞因子及免疫分子共同形成的網(wǎng)絡(luò)，趨化因子及其受體在其中起到了至關(guān)重要的作用4。IL-8除作為角質(zhì)形成細(xì)胞活化因子外，和GRO-一道還是組織炎癥的介導(dǎo)

30、者，對中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞具有重要的生物學(xué)作用?，F(xiàn)認(rèn)為T細(xì)胞依賴性免疫機(jī)制在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用5，但對T細(xì)胞在皮損部位聚集的機(jī)制仍未完全闡明，多種細(xì)胞因子及黏附分子可能參與了T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)。IL-8、GRO-在體外均可趨化T細(xì)胞6，7，因此推測IL-8、GRO-和CXCR2相互作用，可能也對T細(xì)胞向炎癥部位的移行起作用。銀屑病皮損部位真皮乳頭具有高表達(dá)的GRO-1，皮損部位真皮浸潤的中性粒細(xì)胞表達(dá) CXCR2 mRNA 增高3。但Kulke 等3發(fā)現(xiàn)皮損部位角質(zhì)層中聚集的中性粒細(xì)胞表面測不到CXCR2，提示當(dāng)中性粒細(xì)胞已到達(dá)角質(zhì)層后，CXCR2的表達(dá)明顯減少，推測可能是因?yàn)橹行粤＜?xì)胞在向皮損部位表皮中移行的過程中發(fā)揮了功能后產(chǎn)生了某些變化，失去了其原有特征的結(jié)果。      本研究結(jié)果表明銀屑病患者皮損部位表皮和真皮、外周血中性粒細(xì)胞及單一核細(xì)胞中表達(dá)CXCR2 mRNA均增高，提示