重組pDC316-MCMV hNIS真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在腫瘤細(xì)胞的功能研究

1、重組pDC316-MCMV/ hNIS真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在腫瘤細(xì)胞的功能研究                  作者：周泉波， 陳汝福， *花， 周嘉嘉， 唐啟彬， 陳積圣 【摘要】  【目的】 克隆人的鈉/ 碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(hNIS) 基因可編碼序列，并研究其在非甲狀腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)的功能表達(dá)?！痉椒ā?#16

2、0;利用逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）從毒性彌漫性甲狀腺腫（又稱Graves?。┎∪说募谞钕俳M織中擴(kuò)增得到NIS的可編碼區(qū)基因，并克隆到T載體，測(cè)序后亞克隆到腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC316載體上，獲得重組真核表達(dá)質(zhì)粒載體pDC316MCMV/ hNIS。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，把pDC316-MCMV/ hNIS重組質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)組）或pDC316空質(zhì)粒（對(duì)照組）分別導(dǎo)入到胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-II細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h采用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的hNIS mRNA水平，轉(zhuǎn)染后第2、3、4天分別檢

3、測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)125I的吸收功能?！窘Y(jié)果】 序列分析結(jié)果證實(shí)克隆片段與文獻(xiàn)報(bào)道的hNIS基因cDNA序列完全一致。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后48 h，在CAPAN-II細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞及SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)均能檢測(cè)到hNIS mRNA高水平表達(dá)，對(duì)照組基本無(wú)hNIS mRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)染后第3天細(xì)胞吸碘達(dá)到高峰，實(shí)驗(yàn)組CAPAN-II細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞對(duì)125I的吸收量分別比對(duì)照組高24倍、17倍和13倍?！窘Y(jié)論】 從Graves病人的甲狀腺組織中克隆的hNIS基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，能使腫瘤細(xì)胞發(fā)揮高水平吸碘功能，為進(jìn)一步運(yùn)用放射性核

4、素體內(nèi)靶向治療非甲狀腺腫瘤奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  人鈉/ 碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體； 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)； 基因轉(zhuǎn)染； 碘放射性同位素     鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium iodide symporter,NIS)是主要存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞基底膜上的一種跨膜糖蛋白,在細(xì)胞對(duì)碘的攝取過(guò)程中起著舉足輕重的作用1。隨著對(duì)NIS研究的不斷深入，通過(guò)NIS基因介導(dǎo)放射性核素來(lái)進(jìn)行腫瘤的基因治療是目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一2,3,但在胰腺癌基因治療中少有報(bào)道4。本研究從Gr

5、aves甲亢病人的甲狀腺組織中克隆出人NIS基因的完整編碼區(qū)序列（CDS），并構(gòu)建Pdc316-MCMV/hNIS重組穿梭質(zhì)粒載體，以研究NIS基因轉(zhuǎn)染的胰腺癌等非甲狀腺腫瘤細(xì)胞對(duì)碘的攝取功能。    1   材料與方法    1.1   材料     Graves甲亢病人的甲狀腺組織取自我院乳甲外科?？俁NA提取試劑Trizol reagent和脂質(zhì)體lipofectamine 200

6、0均為Invitrogen公司產(chǎn)品, 2×Pfu PCR MasterMix（KP201）天為時(shí)代公司產(chǎn)品，兩步法RT-PCR 試劑盒Takara公司產(chǎn)品。*性內(nèi)切酶EcoR 、Xba 、Hind 及T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB公司。coli DH5，pDC316 vector由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供，pGEM-T easy載體本試驗(yàn)室保存。胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-2購(gòu)買(mǎi)于中山大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)室,胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1、卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3由本試驗(yàn)室保存。

7、DMEM培養(yǎng)基（GBICO公司）、四季青胎牛血清為威佳公司產(chǎn)品。放射性125I、NaI及KClO4均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。    1.2   NIS基因的擴(kuò)增及與T載體連接    采用Trizol試劑法從1例Graves甲亢病人的甲狀腺組織中抽提總RNA后, 使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,具體方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。根據(jù)重疊PCR方法設(shè)計(jì)4條引物以擴(kuò)增hNIS cDNA全長(zhǎng)1932 bp的基因片段：P1: AT

8、GGAGGCCGTGGAGACCGGGGAAC；P2: CAAACATGACGATGCCACAGCAGGC；P3: CAGGT CGTGGTGATGCTAAGTGGCT；P4: TCAGAGGTTTG TCTCCTGCTGGTCT。分別建立如下3個(gè)反應(yīng)體系: 體系1（擴(kuò)增產(chǎn)物為Fragment 1）：取甲狀腺cDNA 1 L ,P1（10 pmol/L）、P2(10 pmol/L) 各5 L, 2×Pfu PCR M

9、aster Mix  25 L,ddH2O 14 L。體系2（擴(kuò)增產(chǎn)物為Fragment 2）：取P3（10 pmol/L）、P4(10 pmol/L) 各5 L，其余成份同體系1。體系3（擴(kuò)增產(chǎn)物為NIS基因片段）：把Fragment 1和Fragment 2的PCR產(chǎn)物稀釋50倍后混合，取1 L此混合物作為模版，P1（10 pmol/L）、P4(10 pmol/L)各5 L，其余成份同體系1。3個(gè)體系PCR反應(yīng)的條件一致，

10、如下:94 預(yù)變性2 min,94 變性30 s,65 退火30 s,72 延伸3 min ,共作30個(gè)循環(huán),最后于72 延伸10 min,產(chǎn)物放于-20 冰箱中凍存。體系3的PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖電泳后，膠回收目的片段，并與pGEM-T easy載體相連，以方便保存目的基因及亞克隆到其他載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5，利用藍(lán)/白菌落篩選法篩選出陽(yáng)性克隆, 提取其質(zhì)粒DNA，進(jìn)行Nco + Spe酶切鑒定。陽(yáng)性克隆交由上海生物工

11、程公司測(cè)序。    1.3   pDC316-MCMV/hNIS載體的構(gòu)建    根據(jù)腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC316所包含的多克隆位點(diǎn)，采用PCR方法在hNIS基因兩端分別引入EcoR和Hind兩個(gè)酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物為P5： TAGCGAATTCATGGAGGCCGTGGAGACCGG GG和P6:TAGCAAGCTTTCAGAGGTTTGTCTCCT GCTGG。以上述經(jīng)測(cè)序證實(shí)為堿基序列正確的pGEM-T easy/hNIS 質(zhì)粒作為模

12、版，P5、P6為引物擴(kuò)增NIS基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR和Hind雙酶切后回收，與PDC316載體連接后得到重組質(zhì)粒PDC316-MCMV/hNIS。重組產(chǎn)物酶切鑒定后轉(zhuǎn)化到DH5大腸桿菌感受態(tài)后，用LB/Amp平板篩選出陽(yáng)性克隆送上海生物工程公司測(cè)序（本節(jié)具體方法同上段）。    1.4   體外轉(zhuǎn)染    在24孔板中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-2、PANC-1細(xì)胞,卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3(1×105/ 每孔),18 h后待細(xì)胞生長(zhǎng)至

13、密度達(dá)到90%95%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過(guò)程參考lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)。    1.5   RT-PCR方法鑒定細(xì)胞內(nèi)的hNIS基因的mRNA    pDC316-MCMV/hNIS質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)組）和pDC316空質(zhì)粒（對(duì)照組）轉(zhuǎn)染48 h后，Trizol試劑法從腫瘤細(xì)胞內(nèi)提取總RNA,采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒使RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后根據(jù)hNIS的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物P7:GCTAA GTGGCTTCTG

14、GGTTG和P8：GACTGCAGCCAT AGCATTGA,用于擴(kuò)增hNIS cDNA的部分基因片段（+941  +1 142）,以鑒定細(xì)胞內(nèi)hNIS的mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件為: 94 預(yù)變性2 min,94 變性30 s,60 退火30 s,72 延伸1 min,共作30個(gè)循環(huán),最后于72 延伸7 min，產(chǎn)物電泳分析。    1.6  放射性125I吸收實(shí)驗(yàn) 

15、;   pDC316-MCMV/hNIS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為實(shí)驗(yàn)組,未經(jīng)重組的PDC316(不含NIS基因)作為空白對(duì)照組1，實(shí)驗(yàn)組另設(shè)hNIS抑制劑KClO4組做對(duì)照2。每組每種細(xì)胞取4個(gè)復(fù)孔, 重復(fù)轉(zhuǎn)染3次。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后第2、3、4天分別進(jìn)行125I吸收測(cè)定。具體方法：細(xì)胞用HBSS溶液沖洗2次，在含10 mmol/L HEPES, 10 mol/L NaI and 0.1 Ci Na125I/mL(pH 7.3)的HBSS溶液中,37 培養(yǎng)1

16、0;h，對(duì)照組另加入10 mol/L KClO4, 作為NIS吸碘的抑制劑。倒掉培養(yǎng)液，用冰PBS沖洗2次，然后1 mol/L NaOH裂解細(xì)胞，細(xì)胞吸125I用計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘計(jì)數(shù)。    2   結(jié)   果    2.1   hNIS基因（+348+2279）的克隆    PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1，結(jié)果證明擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)擴(kuò)增片

17、段大小一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到重組質(zhì)粒pGEM-T easy/NIS后,經(jīng)Nco + Spe酶切鑒定，表明插入片段正確（圖2）。重組質(zhì)粒送上海生物工程公司檢測(cè)堿基序列，插入基因的測(cè)序結(jié)果與參考序列H.sapiens solute carrier family 5 (sodium iodide symporter),(GenBank accession : NM-000453)的CDS序列完全匹配，同源性為100。    2

18、.2   重組質(zhì)粒pDC316-MCMV/hNIS構(gòu)建的結(jié)果    構(gòu)建的pDC316-MCMV/hNIS 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5后，用LB/Amp平板篩選重組子,挑取陽(yáng)性菌落, 小提質(zhì)粒分別進(jìn)行Xba+EcoR雙酶切和EcoR+Hind雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分析得到與預(yù)期片段大小一致條帶（圖3）。挑取陽(yáng)性克隆送測(cè)序，重組質(zhì)粒中的hNIS基因測(cè)序結(jié)果與T載體內(nèi)的hNIS基因模版序列一致，與參考序列同源性為100。    2.3   腫瘤細(xì)胞

19、內(nèi)hNIS的mRNA水平    RT-PCR方法擴(kuò)增pDC316-MCMV-hNIS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞內(nèi)hNIS的部分編碼基因片段（+941+1 142），以檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后胞內(nèi)hNIS基因的mRNA表達(dá)情況。擴(kuò)增片段電泳鑒定（圖4），結(jié)果表明pDC316-MCMV-hNIS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAPAN-2、PANC-1和SK-OV-3細(xì)胞后都能擴(kuò)增出約500 bp大小的目的條帶，而所有空白組都不能擴(kuò)增出目的條帶。這表明轉(zhuǎn)染組NIS基因的mRNA在CAPAN-2、PANC-1和SK-OV-3均有較高水平表達(dá)，而對(duì)照組（不含NIS基因）轉(zhuǎn)染后沒(méi)有h

20、NIS的mRNA表達(dá)。    2.4   腫瘤細(xì)胞的125I吸收    轉(zhuǎn)染后第2、3、4天分別進(jìn)行細(xì)胞125I吸收測(cè)定，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后第3天細(xì)胞吸125I量最高，在CAPAN-2、PANC-1和SK-OV-3細(xì)胞內(nèi)累計(jì)量分別為（2 859±225）min-1、（2 650±214）min-1、（3 105±325）min-1，比對(duì)照組分別提高24倍、17倍和13倍, 實(shí)驗(yàn)組的高水平吸碘均能夠顯著被KClO4所

21、抑制。結(jié)果表明：pDC316-MCMV/hNIS轉(zhuǎn)染組的3種細(xì)胞都有較高水平吸收125I的功能，并且這種125I的吸收功能都能夠顯著被NIS功能抑制劑KClO4所抑制。對(duì)照組pDC316質(zhì)粒（不含NIS基因）轉(zhuǎn)染后3種細(xì)胞125I的吸收水平都很低。    3   討   論    鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium iodide symporter,NIS)是一種跨膜糖蛋白,屬于鈉/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體家族。NIS主要表達(dá)于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，

22、另外在唾液腺、淚腺、胃黏膜、脈絡(luò)叢、乳腺、卵巢等非甲狀腺組織也有低表達(dá)1。在某些甲狀腺疾病如Graves 病患者甲狀腺組織中,NIS 的表達(dá)量顯著超過(guò)正常組織。NIS的功能主要是通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外相對(duì)稀少的碘離子進(jìn)入甲狀腺細(xì)胞，而能使胞內(nèi)碘濃度超過(guò)血漿碘濃度的2040倍。我們采用RT-PCR方法從Graves 病患者的甲狀腺組織擴(kuò)增出NIS，因?yàn)閿U(kuò)增序列較長(zhǎng)，采用一對(duì)引物均未能擴(kuò)增出NIS基因片段，故選用重疊PCR方法擴(kuò)增?？紤]到重疊PCR引起擴(kuò)增序列突變概率增加，我們選用了Pfu DNA聚合酶以減少錯(cuò)配或插入引起的堿基突變，結(jié)果得到與參考序列完全一致的hN

23、IS編碼序列。擴(kuò)增序列為NIS基因的CDS序列（+348+2 279），堿基數(shù)為1 932 bp，含有完整的閱讀框架, 編碼643個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)。    隨著對(duì)NIS深入研究，人們不再局限于NIS在甲狀腺疾病包括甲狀腺癌的診斷及治療中運(yùn)用2,3，眾多的研究47已經(jīng)表明運(yùn)用NIS介導(dǎo)的核素放射治療非甲狀腺腫瘤已成為可能。Dwyer等8，9利用腫瘤相關(guān)抗原的特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)NIS在乳腺癌及卵巢癌細(xì)胞內(nèi)靶向表達(dá)，并結(jié)合I131治療腫瘤取得了較好的效果。我們用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pDC316-MCMV/hNIS進(jìn)入胰腺癌

24、細(xì)胞株CAPAN-II、PANC-1和卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3,運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)出轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞內(nèi)有hNIS的mRNA的高水平表達(dá)，而空白組pDC316轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后無(wú)hNIS的mRNA表達(dá)或極低表達(dá)。I125吸收試驗(yàn)表明pDC316-MCMV/hNIS轉(zhuǎn)染后的3種腫瘤細(xì)胞都有較高水平的吸碘，且在轉(zhuǎn)染后第3天吸碘達(dá)到高峰，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)I125吸收量是空白組的13倍以上。同時(shí)，這種高水平吸碘125能夠被hNIS功能抑制劑KClO4所抑制。這充分說(shuō)明了hNIS轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后能正常表達(dá)和發(fā)揮吸碘的功能，為進(jìn)一步I131治療腫瘤的研究打下基礎(chǔ)。    

25、目前，所有的基因治療載體均難以轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤全部的細(xì)胞，尤其是在體內(nèi)，因此人們?cè)噲D賦予治療基因以“旁觀者效應(yīng)“，從而使未轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞也得以被殺滅。由于I131等核素發(fā)射的粒子射程達(dá)數(shù)毫米，因此，聯(lián)合應(yīng)用NIS和放射性核素治療腫瘤具有明顯的優(yōu)勢(shì)10。并且hNIS基因轉(zhuǎn)導(dǎo)整合了體內(nèi)基因表達(dá)顯像和基因靶向性放射性核素治療的潛能，通過(guò)治療前的精確劑量計(jì)算可實(shí)現(xiàn)放射性核素治療用量的個(gè)體化。因此，我們?nèi)绻苷业竭m合的特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)NIS基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)靶向表達(dá)，則可能實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向性放射性核素治療。    綜上所述，本研究成功地從甲亢患者的甲狀腺組織獲得了NIS基因可

26、編碼區(qū)基因的克隆,并構(gòu)建了PDC316-MCMV/hNIS重組穿梭質(zhì)粒；并運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將PDC316-MCMV/hNIS重組質(zhì)粒導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使hNIS能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)較高表達(dá)并發(fā)揮吸碘功能。本試驗(yàn)為進(jìn)一步運(yùn)用核素放射作用靶向治療胰腺癌、卵巢癌等非甲狀腺腫瘤奠定了基礎(chǔ), 此進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  陳立波,朱瑞森.NIS在腫瘤核素基因顯像與治療中的應(yīng)用研究J.國(guó)外醫(yī)學(xué)：放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊(cè),2005，29(2):70-73.張一帆,李 彪,趙 龍，等. 桿狀病毒介導(dǎo)NIS基因放射治療甲狀腺癌的實(shí)驗(yàn)研究 J.

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