表面TiO2鍍膜PVC氣管導(dǎo)管抗細(xì)菌污染的研究

1、中青年優(yōu)秀論文評(píng)獎(jiǎng)表面TiO2鍍膜PVC氣管導(dǎo)管抗細(xì)菌污染的研究林財(cái)珠,林群,張劍榮,(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科,福建福州,350004)中文摘要目的建立呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(VAP)家兔模型,研究新型氣管導(dǎo)管-TiO2/PVC(二氧化鈦/聚氯乙烯)氣管導(dǎo)管在抗細(xì)菌生物被膜(BF)形成中的作用, 以新西蘭白兔作為研究對(duì)象,探討在活體氣道環(huán)境下新型氣管導(dǎo)管的實(shí)際抗菌和殺菌性能,為后期的臨床實(shí)驗(yàn)提供基本實(shí)驗(yàn)參數(shù)及依據(jù)。方法將待用氣管導(dǎo)管內(nèi)表面以相同濃度細(xì)菌粘附后插入已麻醉的新西蘭白兔氣管內(nèi)并行機(jī)械通氣48小時(shí),建立呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎家兔模型。 健康新西蘭白兔32只，按插入氣管導(dǎo)管類型及光照處理的不

2、同方式隨機(jī)分為4組,每組8只。 C組（n=8），動(dòng)物經(jīng)口插入標(biāo)準(zhǔn)PVC氣管導(dǎo)管，不經(jīng)光照處理；T組（n=8），動(dòng)物經(jīng)口插入TiO2/PVC氣管導(dǎo)管，不經(jīng)光照處理；C+uv組（n=8），動(dòng)物經(jīng)口插入標(biāo)準(zhǔn)PVC氣管導(dǎo)管+氣管導(dǎo)管內(nèi)表面紫外光照射。T+uv組（n=8），動(dòng)物經(jīng)口插入TiO2/PVC氣管導(dǎo)管+氣管導(dǎo)管內(nèi)表面紫外光照射。機(jī)械通氣48小時(shí)后檢測(cè)氣管導(dǎo)管表面、動(dòng)物氣道及肺組織細(xì)菌負(fù)荷量, 并采用電子掃描電鏡及激光共聚焦掃描電鏡檢測(cè)氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜,最后行肺組織病理檢查并量化評(píng)分,比較各組間上述檢測(cè)指標(biāo)的差異。結(jié)果 T+uv組氣管導(dǎo)管表面的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量菌與其他各組

3、比較明顯增高，存在顯著性差異（P0.01）。T+uv組動(dòng)物呼吸道及肺組織的細(xì)菌負(fù)荷量與與其它各組動(dòng)物比較有顯著的不同，表現(xiàn)為所有在肺組織及氣管內(nèi)定植的需氧菌、銅綠假單胞菌數(shù)量的顯著減少（P0.01）。電子掃描電鏡觀察T+uv組氣管導(dǎo)管表面形成的細(xì)菌生物膜平均厚度明顯小于其它各組（P0.01）激光共聚焦掃描電鏡檢測(cè),T+uv組氣管導(dǎo)管表面形成的細(xì)菌生物膜平均厚度明顯小于其它各組（P0.01）.各組肺組織病理學(xué)評(píng)分，T+uv組動(dòng)物肺組織與C組相比較，肺組織損傷評(píng)分明顯較低 (P0.01)。結(jié)論 呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎家兔模型中,光活化TiO2/PVC氣管導(dǎo)管可明顯抑制其表面細(xì)菌生物被膜生成,有顯著的抗細(xì)

4、菌污染作用。關(guān)鍵詞 呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎 生物被膜二氧化鈦 氣管導(dǎo)管 銅綠假單胞菌 A Study on PVC Endotracheal Tubes Coated with titanium dioxide against Bacterial ColonizationObjective To design a rabbit model of ventilator-associated pneumonia (VAP),and study the function of the new endotracheal tube(TiO2/PVC ETT) against bacterial biolm(B

5、F). To investigate the practical efficiency of the new ETT on antibiosis and sterilization in vivo by using New Zealand white rabbits ,and to provide the basic experimental parameters and evidences .Methods Paralysed rabbits were intubated with used ETTs With the same concentration of Microbial Adhe

6、sion,and were mechanically ventilated for 48 hours. A rabbit model of VAP was designed. Thirty-two major rabbits were divided into 4 groups according to the type of ETTs and different illumination ,with eight animals of every group. Eight rabbits were intubated with a standard ETT without illuminati

7、on (Group C); Eight rabbits were intubated with a TiO2/PVC ETT without illumination (Group T); Eight rabbits were intubated with a standard ETT With ultraviolet radiation (Group C+uv); Eight rabbits were intubated with a TiO2/PVC ETT with ultraviolet radiation (Group T+uv) .After 48 hours' mecha

8、nical ventilation we measured bacteria load on the surface of ETTs the animals air duct and lungs,and analyzed the bacterial biolm on the ETT with scanning electron microscopy and laser scanning confocal microscopy, and sent the lungs of the rabbits to the pathologist for microscopic study for quant

9、ization,then compared the difference of the indexes. Results The amount of alive bacterium including PA and other aerobes on the surface of ETTs in Group T+uv was significantly higher than others , there is significant difference between Group T+uv and other groups(P<0. 01). there is signifi

10、cant difference between Group T+uv and other groups(P<0. 01). As for bacteria load on the surface of ETTs the animals air duct and lungs,Group T+uv was significantly lower than others(P<0. 01) . thickness of BF on the surface of ETTs in Group T+uv is significantly less than other groups b

11、y scanning electron microscopy (P<0. 01). thickness of BF on the surface of ETTs in Group T+uv is significantly less than other groups by laser scanning confocal microscopy (P<0. 01). Comparing microscopic study for quantization among with Group C, thc score in Group T+uv is significantly lowe

12、r than other groups(P0.01).Conclusion In rabbit model of ventilation, TiO2/PVC ETT by photoactivtion can prevent bacterial biolm ,so it can decrease significantly bacterial colonization .Keywords ventilator associated pneumonia;bacterial biofilm;titanium dioxide;Pseudomonas aeruginosa;rabbits生物材料的應(yīng)用

13、極大促進(jìn)醫(yī)學(xué)診療技術(shù)飛速發(fā)展，同時(shí)也增加了細(xì)菌入侵宿主的途徑。由生物材料引起感染（biomaterial centered infections, BCI）的病例近年來(lái)逐年上升，僅美國(guó)每年就有超過(guò)三百萬(wàn)件人工器官或部件植入人體，超過(guò)半數(shù)以上的植入物會(huì)引起人體感染，死亡率達(dá)5%60%，占院內(nèi)感染的45%1。其中，最具災(zāi)難性的BCI當(dāng)屬呼吸系統(tǒng)醫(yī)用級(jí)別聚氯乙烯（PVC）氣管導(dǎo)管長(zhǎng)時(shí)間置入后發(fā)生的感染，特別是呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(ventilator associated Pneumonia ,VAP)成為重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)患者致死的主要原因，這在機(jī)械通氣患者中的發(fā)生率為18 %60 % ,病死率超過(guò)50 %

14、。導(dǎo)管內(nèi)的定植細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致90%的機(jī)械通氣患者反復(fù)發(fā)生感染，通過(guò)這條途徑由某些病原體(如銅綠假單胞菌)所引起VAP的病死率甚至高達(dá)70%80 %2；對(duì)于那些氣管切開需長(zhǎng)期置入PVC氣管套管的患者，細(xì)菌感染更是難以避免。據(jù)報(bào)道，生物材料作為異物不僅影響宿主的免疫機(jī)制，也影響誘發(fā)感染的最低細(xì)菌數(shù)量，主要原因是生物材料為游離細(xì)菌提供粘附的位點(diǎn)，促進(jìn)了細(xì)菌粘附和細(xì)菌生物膜（Bacterial Biofilm, BF）的形成，BF中的細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)、理化特性、抗生素抗性及對(duì)抗機(jī)體免疫防御等方面與普通浮游生長(zhǎng)的細(xì)菌有顯著的不同： BF藻酸鹽層的屏障保護(hù)作用, 使抗菌藥物難以穿透被膜作用于深層細(xì)菌, 停用抗菌

15、藥物后, 這些存活的細(xì)菌就會(huì)游離釋放出來(lái)導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)。 BF結(jié)構(gòu)中不同位置的細(xì)菌生理狀態(tài)各不相同, 處于不同的代謝狀態(tài), 大多數(shù)抗菌藥物不能把休眠菌殺滅, 所以在任何時(shí)候都有一部分細(xì)菌得以存活。藻酸鹽能阻斷中性粒細(xì)胞的鈣通道, 使之無(wú)法表達(dá)與趨化性有關(guān)的受體, 使中性粒細(xì)胞的趨化性減弱, 吞噬作用減弱, 細(xì)菌從而逃逸機(jī)體的免疫攻擊。BF形成后, 細(xì)菌有足夠的時(shí)間來(lái)開啟耐藥基因, 內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)量大大高于浮游菌，這些抗菌藥物水解酶的增加進(jìn)一步減低了進(jìn)入膜內(nèi)抗菌藥物的含量3。這些因素使PVC氣管導(dǎo)管表面的BF成為BCI致病菌重要的、持續(xù)的來(lái)源，是導(dǎo)致BCI臨床治療極為困難的根本原因。因此有效控制和清

16、除PVC導(dǎo)管表面BF的形成將是防治以氣管導(dǎo)管為中心的BCI的關(guān)鍵。以往預(yù)防和治療以氣管導(dǎo)管為中心BCI的研究集中在細(xì)菌污染、侵入途徑、細(xì)菌毒力作用、病人抵抗力、抗菌藥物等方面，雖然取得了一定的效果，但仍然不能有效控制BF的形成。在BCI的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，生物材料、細(xì)菌、宿主三大因素相互聯(lián)系，特別是生物材料表面是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，引起B(yǎng)CI的初始動(dòng)因就是細(xì)菌在生物材料表面的粘附，從本質(zhì)上講這是一個(gè)表面化學(xué)物理過(guò)程，與材料表面特性密切相關(guān)。近年國(guó)外學(xué)者開始嘗試使用各種辦法處理材料表面以期達(dá)到抗細(xì)菌粘附的目的。Jansen等人在表皮葡萄球菌對(duì)植入聚合物材料粘附的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著材料表面張力的增加，細(xì)菌的粘

17、附明顯減少4。Balazs等采用氧輝光放電對(duì)PVC氣管導(dǎo)管進(jìn)行表面改性，增加其親水性，顯著抑制了銅綠假單胞菌在導(dǎo)管表面的粘附5。這表明以預(yù)防為主的PVC氣管導(dǎo)管的表面改性是解決這一問(wèn)題的有效途徑，可能具有巨大的發(fā)展前景，隨著生物材料向分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)發(fā)展，設(shè)計(jì)出具有特定理化特性、抗細(xì)菌粘附及除菌能力的PVC氣管導(dǎo)管將有助于有效防治以氣管導(dǎo)管為中心的BCI。近年來(lái)TiO2（二氧化鈦）材料在化學(xué)中已經(jīng)被廣泛的研究。它化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)毒且具有良好的生物相容性。據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道，TiO2作為納米薄膜可以很好地附著在陶瓷、玻璃、塑料等各種材料的表面，在光照或光照激發(fā)后表現(xiàn)出催化氧化性能和超親水性，這兩個(gè)性

18、質(zhì)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于有機(jī)污染物的光催化氧化消除和自清潔、超親水性涂層材料的制造6。本項(xiàng)目欲將這種技術(shù)引入醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究TiO2光催化劑及其摻雜TiO2復(fù)合物在PVC導(dǎo)管表面的成膜方法并制備出表面具有抑菌和高親水性的納米薄膜，通過(guò)各種手段考察其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的抑制作用和殺滅作用，開發(fā)符合醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)的新型防感染氣管導(dǎo)管。這項(xiàng)技術(shù)的采用估計(jì)會(huì)使PVC導(dǎo)管表面產(chǎn)生如下功能：（1）形成高表面親水性，這會(huì)使具有憎水性的細(xì)菌難以在表面粘附和寄宿，而且由于TiO2隔絕了PVC與細(xì)菌的接觸，也使導(dǎo)管表面難以形成細(xì)菌生物膜；（2）獲得活性表面，當(dāng)它受到光激發(fā)后可以產(chǎn)生電子和空穴，氧化破壞細(xì)菌的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其喪失生

19、物活性，使細(xì)菌難以存活和繁殖。催化劑的這種作用在光照下非常顯著，在光照后有一定時(shí)間的記憶作用，所以在導(dǎo)管使用前后的光活化可以獲得更加顯著的破壞細(xì)菌生長(zhǎng)的效果。通過(guò)賦予導(dǎo)管表面這樣的功能可使氣管導(dǎo)管達(dá)到抗細(xì)菌粘附和殺滅細(xì)菌的效果。結(jié)合前期研究，制備出符合實(shí)際要求的薄膜，在活體氣道環(huán)境下研究樣管的實(shí)際抗菌效果。以新西蘭大白兔作為研究對(duì)象，研究所制PVC導(dǎo)管材料在動(dòng)物氣道內(nèi)的實(shí)際抗菌和殺菌性能。為后期的臨床實(shí)驗(yàn)提供基本實(shí)驗(yàn)參數(shù)，是本課題研究的意義所在。一材料與方法1 材料 儀器設(shè)備 PVC氣管導(dǎo)管 愛爾蘭Mallinckrodt MedicalTiO2/PVC氣管導(dǎo)管 福州大學(xué)光催化研究所醫(yī)用凈化工

20、作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司側(cè)光纖 南京春輝科技實(shí)業(yè)有限公司紫外光光源 Hamamatsu Co., JaPan HP-V24多功能生命體征監(jiān)測(cè)儀 美國(guó)惠普公司普通光學(xué)顯微鏡 日本OLYMPUS公司高壓滅菌鍋 北京凱宏偉業(yè)科技有限公司電子分析天平FC204 上海上平儀器有限公司DH-180H動(dòng)物呼吸機(jī) 浙江醫(yī)學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠激光共聚焦掃描電鏡 Heidelberg, Germany電子掃描電鏡 JSM 6060LV SEM; JEOL Ltd., Tokyo, JaPan 藥品及試劑熒光試劑 LIVE/DEAD BacLightTM Bacterial ViabilityKit , Molecula

21、r Probes,Inc.烏拉坦(20%氨基甲酸乙酯) 上海市曹楊第二中學(xué)化工廠批號(hào)9901156%HES溶液 北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司批號(hào)06101921力月西 江蘇恩華藥業(yè)集團(tuán)有限公司批號(hào)10980025萬(wàn)可松 山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司批號(hào)20067458琥珀酰明膠注射液 沈陽(yáng)貝朗制藥有限公司批號(hào)20040609磷酸鹽緩沖液 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司營(yíng)養(yǎng)瓊脂 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司TiO2溶膠 福州大學(xué)光催化所氯化鈉 廣東西隴化工廠無(wú)水乙醇 廣東西隴化工廠1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年新西蘭白兔32只，體重kg,雌雄不拘。由上海松區(qū)江松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠提供.2 方法2.1 氣管導(dǎo)管表面細(xì)

22、菌粘附 銅綠假單胞菌臨床分離株（PA）（分離自醫(yī)院ICU機(jī)械通氣患者氣管導(dǎo)管表面）。采用哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中36 培養(yǎng), 每24 h 轉(zhuǎn)種1 次以保持PA菌活性。 接種動(dòng)物前將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PA菌配成濃度為1×107 cfu/ ml菌液，然后將氣管導(dǎo)管內(nèi)腔充滿上述菌液，35孵育6 h 后棄菌液。平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌粘附量。經(jīng)上述細(xì)菌粘附處理的導(dǎo)管用于氣管插管。2.2 家兔機(jī)械通氣模型建立動(dòng)物模型的建立: 所有兔實(shí)驗(yàn)前禁食12h，不禁水。以22號(hào)靜脈留置針于兔耳緣靜脈穿刺置管后接5%GNS靜脈輸液.輸液速度10ml/kg/h, 20%烏拉坦1g/kg靜脈麻醉后固定兔四肢并使

23、之呈135度頭后仰位,經(jīng)口插入氣管導(dǎo)管(內(nèi)徑為3.0mm-3.5mm),連接監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè),可見隨呼吸運(yùn)動(dòng)而規(guī)律出現(xiàn)的PetCO2,一般家兔氣管導(dǎo)管置入深度為11-15cm,固定氣管導(dǎo)管后接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣.呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置:VT10-13ml/kg,f:30-40次/分,I:E比為1:2,吸入氧濃度60%.予咪唑安定并萬(wàn)可松靜推使兔自主呼吸消失,再予萬(wàn)可松及咪唑安定微量泵靜脈輸注維持麻醉. 通過(guò)電熱毯維持家兔直腸溫度。分離左頸動(dòng)脈，20G留置針穿刺置管接換能器監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(Mean Arterial Pressure，MAP)。使用多功能生命體征監(jiān)測(cè)儀（型號(hào)HP-V24，美國(guó)惠普公司）監(jiān)測(cè)

24、兔平均動(dòng)脈壓(MAP)、心率、PetCO2、體溫、血氧飽和度(SPO2)并使之維持于正常范圍。動(dòng)物分組 所有動(dòng)物麻醉后明視下經(jīng)口插入經(jīng)細(xì)菌粘附處理的標(biāo)準(zhǔn)PVC氣管導(dǎo)管或者TiO2/PVC氣管導(dǎo)管于氣管內(nèi)，然后接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣48 h。32只動(dòng)物隨機(jī)分為4組： C組（n=8），動(dòng)物經(jīng)口插入標(biāo)準(zhǔn)PVC氣管導(dǎo)管，不經(jīng)光照處理；T組（n=8），動(dòng)物經(jīng)口插入TiO2/PVC氣管導(dǎo)管，不經(jīng)光照處理； C+uv組（n=8），動(dòng)物經(jīng)口插入標(biāo)準(zhǔn)PVC氣管導(dǎo)管+氣管導(dǎo)管內(nèi)表面紫外光照射。T+uv組（n=8），動(dòng)物經(jīng)口插入TiO2/PVC氣管導(dǎo)管+氣管導(dǎo)管內(nèi)表面紫外光照射。 機(jī)械通氣期間對(duì)氣管導(dǎo)管內(nèi)壁行光催化

25、消毒的光照方法光照裝置對(duì)于C+uv組及T+uv組,氣管導(dǎo)管內(nèi)須引入紫外光照射,為了避免光照可能導(dǎo)致的氣道損傷，我們?cè)谕馄陂g通過(guò)側(cè)發(fā)光紫外光纖向?qū)Ч軆?nèi)引入紫外光，進(jìn)行光催化滅菌；所使用的光纖前端設(shè)置一個(gè)保護(hù)套，避免光線直接向前照射。該法已經(jīng)向國(guó)家專利局申請(qǐng)發(fā)明專利。光纖直徑，這樣既可達(dá)到催化消毒目的，又能保證在光催化時(shí)行機(jī)械通氣，光照方法如圖1所示圖1 機(jī)械通氣期間對(duì)氣管導(dǎo)管內(nèi)壁行光催化消毒的光照裝置（1）紫外光波長(zhǎng)：365nm；（2）光照強(qiáng)度：0.15 mw/cm2；（3）光照時(shí)間：氣管插管后每8h光照一次，每次30min；（4）光源：Lightningcure LC8 （Hamamatsu

26、 Co., JaPan）；（5）溫度3738；（6）管腔內(nèi)濕度100%。3 主要監(jiān)測(cè)指標(biāo)：體外條件下導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌粘附量檢測(cè)： 導(dǎo)管內(nèi)表面體外條件下細(xì)菌粘附6小時(shí)后，橫斷切取1cm片段，置入5ml無(wú)菌生理鹽水中，超聲震蕩洗脫粘附菌，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌粘附量。細(xì)菌粘附量以cfu/cm來(lái)度量。機(jī)械通氣48小時(shí)后氣管導(dǎo)管表面、動(dòng)物氣道及肺組織細(xì)菌負(fù)荷量檢測(cè)：機(jī)械通氣48h后，過(guò)量麻醉處死動(dòng)物。無(wú)菌條件下移除氣管導(dǎo)管，導(dǎo)管外表面75%乙醇消毒，無(wú)菌刀片橫斷切取氣管導(dǎo)管距尖端、3cm處各2mm導(dǎo)管片段，分別置入5ml無(wú)菌生理鹽水中，超聲震蕩洗脫粘附菌，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)氣管導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌數(shù)量。細(xì)菌

27、粘附量以cfu/cm來(lái)度量。嚴(yán)格無(wú)菌條件下，切取氣管及每個(gè)右側(cè)肺葉并稱重，每個(gè)組織樣本取1g左右分別置于1 ml無(wú)菌生理鹽水中，冰浴下勻漿。取得的勻漿液立即送微生物檢驗(yàn)室，采用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。細(xì)菌粘附量以cfu/g組織來(lái)度量。3.1.3 氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜檢測(cè)為了評(píng)價(jià)導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌生物被膜細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，無(wú)菌條件下上述導(dǎo)管位置各橫斷切取2個(gè)2mm長(zhǎng)度的導(dǎo)管片段。激光共聚焦掃描電鏡及電子掃描電鏡觀察。（1）激光共聚焦顯微鏡觀察導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜熒光染液的配制：熒光染色劑為L(zhǎng)7012 LIVE/DEAD BacLight TM Bacterial Viability

28、 Kit (MolecularProbes Inc) , 含有2 種染液SYTO9 和PI , 其中SYTO9使活細(xì)菌發(fā)出綠色熒光，而PI 則使死細(xì)菌發(fā)出紅色熒光，從而可以在鏡下區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌。熒光染液的配制按SYTO9PI蒸餾水= 1. 5l1. 5l1ml比例將3 種試劑加入同一離心管，振蕩混勻備用。每一導(dǎo)管片段用染液50l 。以上操作均在避光條件下進(jìn)行。氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜熒光染色：每個(gè)導(dǎo)管位置各取1個(gè)導(dǎo)管片段。將導(dǎo)管片段用1ml 無(wú)菌蒸餾水輕輕洗滌，以去除未粘附的細(xì)菌,然后放在蓋玻片上，小心吸去蒸餾水，在導(dǎo)管環(huán)片段內(nèi)滴加50l 上述熒光染液, 立即置入暗盒內(nèi)，室溫孵育15 mi

29、n。 CLSM觀察氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物膜: 將上述已完成熒光染色的導(dǎo)管片段進(jìn)行Leica TCS-SP2 激光共聚焦掃描電鏡 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Heidelberg, Germany)掃描并獲取圖像。觀察條件: 氬激光(514/488nm)，HeNe 激光(543nm)，物鏡×20，水鏡×63。每個(gè)生物膜標(biāo)本由上(導(dǎo)管環(huán)背離玻片的一面) 向下(導(dǎo)管環(huán)和玻片相貼的一面) 逐層掃描, 步距為1m，所有數(shù)據(jù)都儲(chǔ)存到電腦硬盤上，通過(guò)隨機(jī)附帶的專業(yè)軟件處理,可以得到生物膜的斷層掃描圖像、生物膜的厚度。圖2 激光共聚焦顯微鏡獲取氣

30、管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜圖像示意圖（2）掃描電鏡觀察氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物膜另外2個(gè)2mm長(zhǎng)度的導(dǎo)管片段無(wú)菌PBS緩沖液沖洗后，新鮮配制的2.5%戊二醇PBS溶液中固定過(guò)夜。PBS緩沖液清洗，1%鋨酸固定4h，蒸餾水清洗，酒精逐級(jí)脫水，叔丁醇置換，冷凍干燥儀干燥，上臺(tái)噴金后高真空掃描電鏡 (JSM 6060LV SEM; JEOL Ltd., Tokyo, JaPan)檢測(cè)并拍照。肺組織病理學(xué)檢測(cè)無(wú)菌條件下切取左肺，真空抽氣技術(shù)下10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，蘇木精伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察。肺組織損傷評(píng)分采用改良評(píng)分系統(tǒng)，由病理學(xué)專家盲法評(píng)分。肺組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：1、充血：0分，無(wú)充

31、血；1分（輕度），肺毛細(xì)血管充血擴(kuò)張；2分（中度），肺毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，部分肺泡內(nèi)充滿漿液或血液；3分（重度），肺毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，大部分肺泡腔內(nèi)充滿漿液或血液。2、水腫：0分，無(wú)水腫；1分（輕度），輕度肺間質(zhì)水腫；2分（中度），中度度肺間質(zhì)水腫，部分肺泡內(nèi)充滿漿液；3分（重度），嚴(yán)重的肺間質(zhì)水腫，大部分肺泡內(nèi)充滿大量漿液。3、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)：0分，肺泡及肺間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1分（輕度），偶見中性粒細(xì)胞，個(gè)別肺泡及肺間質(zhì)見大單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞；2分（中度），大部分肺泡、肺間質(zhì)見中等數(shù)量的中性粒細(xì)胞、大單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；3分（重度），大部分肺泡、肺間質(zhì)中見大量的中性粒細(xì)胞、大單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞

32、。4、細(xì)菌：0分，無(wú)可見細(xì)菌；1分（輕度），肺毛細(xì)血管充血擴(kuò)張；2分（中度），吞噬細(xì)胞內(nèi)偶見細(xì)菌；3分（重度），肺泡、肺間質(zhì)、吞噬細(xì)胞內(nèi)見大量細(xì)菌。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（- x ±s）表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況各組家兔體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P）（見表1） 表1 各組家兔一般情況比較（- x ±s）組別例數(shù)體重（kg） C8T8C+uv8T+uv82氣管插管前導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌粘附量C、T、C+uv、T+uv各組氣管導(dǎo)管內(nèi)表

33、面細(xì)菌數(shù)量分別為×106cfu/cm、×106cfu/cm、×106cfu/cmt和×106cfu/cm，組間差異無(wú)顯著性（P）,提示動(dòng)物氣道內(nèi)細(xì)菌接種量各組無(wú)差異,見表2。表2 各組家兔氣管插管前導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌粘附量（- x ±s）組別例數(shù)細(xì)菌粘附量（cfu/cm） C8×106T8×106 C+uv8×106 T+uv8×1063.機(jī)械通氣48小時(shí)后氣管導(dǎo)管表面、動(dòng)物氣道及肺組織細(xì)菌負(fù)荷量 在銅綠假單胞菌致機(jī)械通氣肺炎動(dòng)物模型中，以PVCPVC氣管導(dǎo)管為對(duì)照，考察了有光照和無(wú)光照條件下溶膠凝膠法制備的

34、TiO2/PVC氣管導(dǎo)管對(duì)導(dǎo)管表面、動(dòng)物氣道及肺組織中細(xì)菌負(fù)荷量的影響。在機(jī)械通氣期間通過(guò)側(cè)發(fā)光紫外光纖向?qū)Ч軆?nèi)引入波長(zhǎng)為365nm的紫外光（光照強(qiáng)度：0.15 mw/cm2，光照時(shí)間設(shè)定為氣管插管后每8h光照一次，每次30min），進(jìn)行光催化滅菌。結(jié)果如圖3、4所示。圖3 機(jī)械通氣48小時(shí)氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌負(fù)荷量（a） （b）圖4 機(jī)械通氣48小時(shí)后動(dòng)物氣道及肺組織細(xì)菌負(fù)荷量(a)氣管 (b)肺組織可以看出，在紫外光光照照射下，機(jī)械通氣動(dòng)物氣道內(nèi)的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量菌均明顯少于標(biāo)準(zhǔn)PVC氣管導(dǎo)管（P0.01）（圖3）。為了排除TiO2/PVC氣管導(dǎo)

35、管的抗菌作用可能來(lái)自紫外光照射的直接的殺菌作用，我們同時(shí)也考察了紫外光光照射及無(wú)紫外光光照射對(duì)PVC氣管導(dǎo)管表面活菌數(shù)量的影響。結(jié)果顯示，在紫外光光照射下及無(wú)紫外光光照射下，PVC氣管導(dǎo)管表面的活菌數(shù)量并無(wú)明顯的差別（P0.01）（圖4），可見上述紫外光光照條件對(duì)導(dǎo)管表面的粘附菌的活性幾乎沒有影響。因此可認(rèn)為，TiO2/PVC氣管導(dǎo)管的抗菌性能與其光催化殺菌及抗細(xì)菌粘附性能密切相關(guān)。從圖4可以看出，T+uv組動(dòng)物使用光活化TiO2/PVC氣管導(dǎo)管進(jìn)行機(jī)械通氣48小時(shí)后，其呼吸道及肺組織的細(xì)菌負(fù)荷量與與其它各組動(dòng)物比較有顯著的不同，表現(xiàn)為所有在肺組織及氣管內(nèi)定植的需氧菌、銅綠假單胞菌數(shù)量的顯著減

36、少（P0.01）。這可歸因于機(jī)械通氣期間光活化TiO2/PVC氣管導(dǎo)管的光催化抗菌作用減少了其表面的細(xì)菌定植，進(jìn)而也減少了細(xì)菌從導(dǎo)管表面隨通氣氣流及各種氣道操作（如吸痰）向氣道內(nèi)、肺內(nèi)播散。這說(shuō)明，機(jī)械通氣過(guò)程中使用光活化TiO2/PVC氣管導(dǎo)管將有助于減少機(jī)械通氣期間呼吸系統(tǒng)感染的風(fēng)險(xiǎn)。3.氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜檢測(cè)細(xì)菌生物被膜的形成是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境而采取的一種生存策略。生物被膜中的細(xì)菌無(wú)論其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理、生化特性還是對(duì)抗菌藥物的敏感性都與普通浮游生長(zhǎng)的細(xì)菌有顯著的不同，致病特性也不同，是造成難治性呼吸道感染性疾病的重要病因之一。我們采用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）及掃描電鏡對(duì)PVC

37、導(dǎo)管表面形成的細(xì)菌生物被膜進(jìn)行考察。圖5 機(jī)械通氣48小時(shí)后動(dòng)物氣道內(nèi)PVC氣管導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌生物被膜形成圖5為CLSM下見到的機(jī)械通氣48小時(shí)后動(dòng)物氣道內(nèi)PVC氣管導(dǎo)管內(nèi)表面完整的菌斑生物膜結(jié)構(gòu)圖片?？梢钥吹郊?xì)菌生物被膜中細(xì)菌分別被染成綠色和紅色，綠色的為活細(xì)菌，紅色的為死細(xì)菌；也有呈橙色或桔黃色，由死菌和活菌重疊造成。細(xì)胞之間有許多未被染色的黑暗區(qū)域，呈管狀或泡狀。細(xì)胞較密集, 可觀察到平滑的生物膜內(nèi)有大量細(xì)菌的存活。許多向外突起的細(xì)胞團(tuán)塊被眾多暗黑的管道系統(tǒng)所分隔。PVC氣管導(dǎo)管內(nèi)表面完整的菌斑生物膜管腔面及橫斷面掃描電鏡圖像。可以看到，導(dǎo)管表面被表面大量厚度不均的高密度細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋，

38、其內(nèi)包裹的大量細(xì)菌團(tuán)塊依稀可見。說(shuō)明機(jī)械通氣48小時(shí)PVC氣管導(dǎo)管已經(jīng)可以形成成熟的細(xì)菌生物被膜。ab圖6 機(jī)械通氣48小時(shí)后電子掃描電鏡觀察氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜a. 細(xì)菌生物被膜橫斷面 b.氣管導(dǎo)管管細(xì)菌生物被膜管腔面。以PVC氣管導(dǎo)管為對(duì)照，在紫外光照射或無(wú)紫外光照射下，考察了紫外光活化對(duì)機(jī)械通氣期間TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜形成的影響。結(jié)果如圖7所示。ba圖7 機(jī)械通氣48小時(shí)后TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜形成 （a）無(wú)光照 （b）光照可以看到, C組機(jī)械通氣48h時(shí)PVC氣管導(dǎo)管表面生物膜均已經(jīng)形成相當(dāng)厚度，細(xì)菌密集，有些成團(tuán)塊狀，層層疊疊如層積云，如棉絮

39、樣，其活菌比例相對(duì)較高，管道較多且粗。而在T+uv組TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面生物膜則較薄，其內(nèi)細(xì)胞層中可見許多細(xì)菌團(tuán)塊，其活菌比例相對(duì)較低。機(jī)械通氣48h時(shí)各組氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜厚度見圖8?？梢钥闯?，在紫外光照射下T組TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面形成的細(xì)菌生物膜平均厚度明顯小于其它各組（P）。這說(shuō)明在光活化后，溶膠凝膠法制備的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管具有較高的光催化抗菌活性，在機(jī)械通氣過(guò)程中可以顯著抑制導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜的形成。 圖圖8.4肺組織病理學(xué)改變我們進(jìn)一步考察其對(duì)肺組織病理學(xué)改變的影響。結(jié)果如圖9所示。圖9 銅綠假單胞菌氣管導(dǎo)管內(nèi)粘附+機(jī)械通氣48h后兔肺組織病理學(xué)改變

40、（HE染色 400） (a) C組（b）T+uv組ab從圖9中可以看出，銅綠假單胞菌氣管導(dǎo)管內(nèi)粘附及機(jī)械通氣48h后，C組使用PVC氣管導(dǎo)管的動(dòng)物肺組織病理學(xué)發(fā)生明顯的炎癥性病理改變，表現(xiàn)為明顯的肺間質(zhì)、肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。T+uv組采用光活化的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管的動(dòng)物肺組織炎癥改變則不明顯。圖10為各組肺組織病理學(xué)評(píng)分?？梢钥闯?，T+uv組動(dòng)物肺組織與其它各組相比較，肺組織損傷評(píng)分明顯較低 (P0.01)。上述結(jié)果說(shuō)明在機(jī)械通氣過(guò)程中使用光活化的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管可以減輕銅綠假單胞菌所致機(jī)械通氣肺炎模型動(dòng)物肺部炎癥改變。這與光活化的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管可以明顯減輕動(dòng)物呼吸道及

41、肺組織的細(xì)菌負(fù)荷量密切相關(guān)。討論隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展,呼吸機(jī)被越來(lái)越普遍地運(yùn)用在臨床的各種原因?qū)е碌暮粑系K的患者身上,盡管呼吸機(jī)作為一種新興的治療手段拯救了許多患者的生命, 但在使用呼吸機(jī)的過(guò)程中引起的各種并發(fā)癥逐漸被人們所重視。呼吸機(jī)引起的并發(fā)癥很多, 其中最為嚴(yán)重的是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎，目前隨著新型生物材料應(yīng)用的增多,細(xì)菌生物被膜( biofilm ,BF)與VAP的關(guān)系也開始受到重視7。氣管導(dǎo)管(endotracheal tube ,ETT)內(nèi)BF與VAP的關(guān)系也逐漸成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及微生物學(xué)專家共同關(guān)注的問(wèn)題。研究證實(shí),BF的形成及播散入肺是VAP發(fā)病的重要發(fā)病機(jī)制。BF是細(xì)菌為

42、適應(yīng)自然環(huán)境吸附于醫(yī)學(xué)生物材料或機(jī)體腔道黏膜表面,分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復(fù)合物(即所謂的“藻酸鹽”) ,并將其自身包繞其中而形成的一種融合的非結(jié)晶膜樣物。銅綠假單胞菌BF的形成過(guò)程主要分為三個(gè)階段:細(xì)菌首先粘附固著于固體物質(zhì)表面。吸引周圍同種細(xì)菌,使之聚集,增殖為小菌落。細(xì)菌分化形成外被胞外多糖基質(zhì)包繞的成熟BF。在上述過(guò)程中細(xì)菌發(fā)生一系列基因序列表達(dá),完成從單體細(xì)胞向多細(xì)胞的演變 ,形成不同結(jié)構(gòu)的BF8。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(scanning confocal lasermicroscoPy ,SCLM)以原位觀察活體BF時(shí)發(fā)現(xiàn),在BF內(nèi)有著相互交通的水通道(water c

43、hannels),細(xì)菌生存所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物可經(jīng)此進(jìn)出BF深層. 研究認(rèn)為,有45 %的正常人在睡眠中發(fā)生口咽分泌物的微量吸入,而在MV患者,尤其是伴有意識(shí)障礙、術(shù)后狀態(tài)、鼻飼者可高達(dá)90 %9,這是VAP的重要發(fā)病機(jī)制之一。在插入ETT后, ETT不僅不能預(yù)防這種誤吸,還削弱了咽下反射及上氣道的過(guò)濾防御機(jī)能 ,以BF形式寄殖于管腔內(nèi)的細(xì)菌能逃避機(jī)體免疫和抗生素的雙重殺滅作用,從而充當(dāng)了病原菌的庇護(hù)所和放大器作用,成為VAP發(fā)病的一個(gè)重要病原來(lái)源.基于BF形成的階段特點(diǎn),設(shè)計(jì)出具有特定理化特性、抗細(xì)菌粘附及除菌能力的PVC氣管導(dǎo)管將有助于有效防治以氣管導(dǎo)管為中心的BCI，具有巨大的發(fā)展前

44、景。針對(duì)BF 形成首先起始于粘附生物醫(yī)學(xué)材料表面的特性,國(guó)外已在開發(fā)新的生物聚合材料或采用特殊內(nèi)涂層以使細(xì)菌的粘附性減至最少10,另外還有應(yīng)用可定期更換的雙層內(nèi)套管技術(shù)及抗生素飽和滲透處理導(dǎo)管技術(shù)報(bào)道 ,但都未見臨床應(yīng)用11.涂銀ETT可顯著降低研究組動(dòng)物ETT腔內(nèi)和肺組織內(nèi)細(xì)菌寄殖數(shù)量12。采用吸附有磺胺嘧啶銀和洗必泰的無(wú)菌濾紙粘附于內(nèi)壁的ETT進(jìn)行研究,也取得了類似結(jié)果。英國(guó)的Adair等對(duì)比了霧化慶大霉素(80mg q8h)和靜脈注射頭孢菌素對(duì)ETT內(nèi)BF的影響 ,也取得了較理想的結(jié)果13,14。近年來(lái)TiO2材料在化學(xué)中已經(jīng)被廣泛的研究。它化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)毒且具有良好的生物相容性。據(jù)大

45、量文獻(xiàn)報(bào)道，TiO2作為納米薄膜可以很好地附著在陶瓷、玻璃、塑料等各種材料的表面，在光照或光照激發(fā)后表現(xiàn)出催化氧化性能和超親水性，這兩個(gè)性質(zhì)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于有機(jī)污染物的光催化氧化消毒（空氣凈化、污水處理和抑菌及殺菌）和自清潔、超親水性涂層材料的制造。這為改進(jìn)PVC氣管抗菌性能提供了一條可行的解決思路。 前期分別采用溶膠凝膠法和懸漿提拉法制備出附著力強(qiáng)和光催化活性優(yōu)良的TiO2薄膜，前者稱之為TPP，后者稱之為PTP，研究證實(shí)PTP在預(yù)光照12h后（PTP-12h），表現(xiàn)最高抗菌活性，隨后趨于穩(wěn)定。TPP和PTP-12h兩種膜對(duì)不同細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)抗粘附作用，其中PTP-12h膜的性能更為優(yōu)良

46、。365nm紫外光照下，樣片對(duì)大腸桿菌殺滅能力按照強(qiáng)弱分為PTP-12h TPP PTP。PTP-12h在光照90分鐘后可將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌全部殺滅。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果,新型氣管導(dǎo)管采用PTP鍍膜,并以此建立機(jī)械通氣動(dòng)物模型,研究此種氣管導(dǎo)管在活體內(nèi)的抗菌性能,以此考證此新型氣管導(dǎo)管在抑制細(xì)菌生物被膜形成過(guò)程中的作用,論證其抗菌效能。 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒅?應(yīng)用紫外光用來(lái)催化TiO2薄膜的抗菌性能,考慮到紫外光對(duì)活體的可能損傷作用, 我們自制了側(cè)發(fā)光紫外光纖向?qū)Ч軆?nèi)引入紫外光，這樣的光催化方式使得紫外光只能從光纖側(cè)孔對(duì)導(dǎo)管內(nèi)層TiO2薄膜進(jìn)行催化,光纖前端設(shè)置一個(gè)保護(hù)套，避免光線直接向前照射而

47、引起氣道粘膜的損傷。 在動(dòng)物機(jī)械通氣前,待用氣管導(dǎo)管全部采用相同濃度的臨床菌株處理,并用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)氣管導(dǎo)管細(xì)菌粘附量,各組氣管導(dǎo)管內(nèi)表面細(xì)菌數(shù)量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示動(dòng)物氣道內(nèi)細(xì)菌接種量各組無(wú)差異。經(jīng)這一系列處理的氣管導(dǎo)管用于建立肺炎動(dòng)物模型,保證了組間比較的均衡性。有學(xué)者通過(guò)對(duì)BF致病菌進(jìn)行細(xì)菌類型鑒定，分離出的微生物包括上呼吸道寄殖菌叢、金黃色葡萄球菌、腸道菌群、銅綠假單孢菌、其他G-菌株及白念珠菌屬等,多數(shù)呈G+球菌和G-桿菌的混合生長(zhǎng),其中30%為院內(nèi)獲得性肺炎的常見致病菌 ,可呈彌漫性或局灶性分布,每厘米管長(zhǎng)的細(xì)菌密度可高達(dá)106cfu15 ?？紤]到呼吸道以這些致病菌為主,本研究

48、以氣道內(nèi)的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量為研究指標(biāo),既涵蓋了本研究中預(yù)先粘附的細(xì)菌,又包括動(dòng)物體內(nèi)原來(lái)的上呼吸道寄殖菌叢,探討TiO2/PVC氣管導(dǎo)管抑制細(xì)菌的作用.結(jié)果顯示, 在紫外光光照照射下，機(jī)械通氣動(dòng)物氣道內(nèi)的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量菌均明顯少于標(biāo)準(zhǔn)PVCPVC氣管導(dǎo)管（P0.01），同樣也顯著少于PVC氣管導(dǎo)管表面活菌數(shù)量（P0.01）,證明了新型氣管導(dǎo)管的抑菌性能。 生物被膜具有高粘附性，尤其是長(zhǎng)期留置導(dǎo)管者。雖然電鏡觀察樣本在制作中使占生物被膜空間65% 95%的多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等高水化成分被壓縮

49、，但仍可看到生物被膜的特殊分層立體結(jié)構(gòu)，其基底層基質(zhì)的存在，支持先有呼吸道分泌物在管腔的粘附，再有細(xì)菌寄殖的發(fā)現(xiàn)16。ETT內(nèi)腔外壁的表面特性可影響到積聚物的吸附、累積和演變。生產(chǎn)工藝過(guò)程所致的表面MurP hy ,s小孔的存在、不規(guī)則設(shè)計(jì)及不良光滑度均提供了BF 形成的最初病灶核心。聚氯乙烯塑料有利于細(xì)菌的粘附 ,Portex 管的不透光層也有利于積聚物的累積17。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和ETT內(nèi)壁并無(wú)直接的接觸 ,而上呼吸道分泌物在管腔表面的粘附先于細(xì)菌的寄殖。細(xì)菌依靠范德華力、疏水力等與基底層結(jié)合 ,隨后分泌大量的胞外多糖聚合物 ,隨著粘附細(xì)菌的增多及生長(zhǎng)分化 ,就形成了一層主要由多糖聚合物包

50、繞細(xì)菌并含有其它復(fù)雜成分的BF18。細(xì)菌在管壁上團(tuán)狀叢生并突出于管腔，容易受到氣體及流體力學(xué)作用，從而被逐入下呼吸道成為致病因子.本實(shí)驗(yàn)中,T+uv組的生物被膜厚度明顯小于C組,也小于其他兩組,提示了光活化TiO2/PVC氣管導(dǎo)管可明顯抑制其表面細(xì)菌生物被膜生成。 Inglis發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械通氣模型中,BF 主要位于通氣機(jī)“Y” 型接頭靠近患者側(cè)的環(huán)路和ETT內(nèi) ,呈不同厚度的非均勻分布 ,積聚最多的部位在管子的下端 ,厚度可達(dá) 0. 5mm 或以上 ,可呈波浪狀、 蘑菇狀、 柱狀 ,部分管子的尖端斜面處或臨近區(qū)域BF缺失隨著插管時(shí)間延長(zhǎng) ,BF 呈特殊的分層排列 ,細(xì)菌間由多糖蛋白連接。細(xì)

51、菌在 BF 中的植入方式從形態(tài)上分為表面或表層的浮游細(xì)菌散在包埋于多糖外被內(nèi) ,或呈團(tuán)狀叢生、部分突出于內(nèi)腔的細(xì)菌團(tuán)19。Koerner用SCLM 發(fā)現(xiàn) , ETT腔壁上最早的非結(jié)晶層在插管后11小時(shí)既已形成。插管24小時(shí)內(nèi)即可發(fā)生細(xì)菌的管腔內(nèi)定殖且逐漸增加 ,48小時(shí)細(xì)菌生物被膜基本形成,5 天后進(jìn)入相對(duì)平衡狀態(tài)20.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之相符,機(jī)械通氣48小時(shí)后用SCLM可觀察到動(dòng)物氣道內(nèi)PVC氣管導(dǎo)管內(nèi)表面完整的菌斑生物膜?？梢钥吹郊?xì)菌生物被膜中細(xì)菌分別被染成綠色和紅色，綠色的為活細(xì)菌，紅色的為死細(xì)菌；也有呈橙色或桔黃色，由死菌和活菌重疊造成。細(xì)胞之間有許多未被染色的黑暗區(qū)域，呈管狀或泡狀。

52、細(xì)胞較密集, 可觀察到平滑的生物被膜內(nèi)有大量細(xì)菌的存活。許多向外突起的細(xì)胞團(tuán)塊被眾多暗黑的管道系統(tǒng)所分隔?？梢钥吹? C組機(jī)械通氣48h時(shí)PVC氣管導(dǎo)管表面生物膜均已經(jīng)形成相當(dāng)厚度，細(xì)菌密集，有些成團(tuán)塊狀，層層疊疊如層積云，如棉絮樣，其活菌比例相對(duì)較高，管道較多且粗。而在T+uv組TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面生物膜則較薄，其內(nèi)細(xì)胞層中可見許多細(xì)菌團(tuán)塊，其活菌比例相對(duì)較低。機(jī)械通氣48h時(shí)各組氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜厚度見圖8。可以看出，在紫外光照射下T組TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面形成的細(xì)菌生物膜平均厚度明顯小于其它各組（P0.01）。這說(shuō)明在光活化后，溶膠凝膠法制備的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管

53、具有較高的光催化抗菌活性，在機(jī)械通氣過(guò)程中可以顯著抑制導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜的形成。上述結(jié)果說(shuō)明在機(jī)械通氣過(guò)程中使用光活化的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管可以減輕銅綠假單胞菌所致機(jī)械通氣肺炎模型動(dòng)物肺部炎癥改變。這與光活化的TiO2/PVC氣管導(dǎo)管可以明顯減輕動(dòng)物呼吸道及肺組織的細(xì)菌負(fù)荷量密切相關(guān)。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中各組動(dòng)物肺組織的炎癥變化,采用光學(xué)顯微鏡觀察,肺組織損傷評(píng)分采用改良評(píng)分系統(tǒng)，由病理學(xué)專家盲法評(píng)分。以此方法將肺組織病理變化量化,有利于肺組織損傷的評(píng)價(jià)及比較.T+uv組動(dòng)物肺組織與C組相比較，肺組織損傷評(píng)分明顯較低 (P0.01),有力地證實(shí)了T+uv組的肺損傷程度遠(yuǎn)較其他組小。結(jié)論1.機(jī)械通

54、氣期間,在365nm的紫外光照下，TiO2/PVC氣管導(dǎo)管表面粘附的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量明顯減少。2/PVC氣管導(dǎo)管可明顯抑制其表面細(xì)菌生物被膜生成。3.機(jī)械通氣期間,光活化TiO2/PVC氣管導(dǎo)管比普通PVC氣管導(dǎo)管肺部炎癥改變明顯減輕。參考文獻(xiàn)1 Lorenzo Berra, M.D., Lorenzo De Marchi, M.D., et al . Endotracheal Tubes Coated with Antiseptics Decrease Bacterial Colonization of the Ventilator Circuits, Lungs J .

55、Anesthesiology 2004; 100:14461456.2 Kozlow JH, Berenholtz SM, Garrett E, Dorman T, Pronovost PJ: Epidemiol-ogy and impact of aspiration pneumonia in patients undergoing surgery in Maryland, 19992000. Crit Care Med 2003; 31:19301937.3 武慶平,姚尚龍,袁世熒.呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎動(dòng)物模型的建立 J. 中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué), 2005, 8: 501-502.4 Prince AS: Biolms, antimicrobial re