穹窿切斷并摘除腎上腺后大鼠下丘腦CRH表達(dá)變化

1、穹窿切斷并摘除腎上腺后大鼠下丘腦CRHCRH表達(dá)變化作者：張彥慧，石玉秀，鄭小桃，符皎榮，鐘南田，洪燈(corticotropi n releasi ng hormo ne, CRH)與糖皮質(zhì)激素的關(guān)系， 探討海馬參與HPA軸調(diào)節(jié)的機(jī)制。方法：建立大鼠穹窿切斷模型，采用ELISA方法檢測(cè)穹窿切斷0、4、7、Wd血中糖皮質(zhì)激素的濃度；建立大鼠穹窿切斷同時(shí)摘除腎上腺7d的模型，采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡方法檢測(cè)CRH的表達(dá)變化。結(jié)果：穹窿切斷7d后血中糖皮 質(zhì)激素的濃度達(dá)升高。結(jié)論：海馬通過(guò)穹窿對(duì)HPA軸發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，糖皮質(zhì)激素負(fù)反饋調(diào)節(jié)下丘腦CRH【關(guān)鍵詞】穹窿切斷術(shù)；穹窿切斷并摘除腎上腺

2、；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素；下丘腦（作者:單位:郵編:【摘要】【摘要】目的=觀察下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素升高，穹窿切斷同時(shí)摘除腎上腺7d后，下丘腦CRH表ABSTRACT Objective: To observe the relati on betwee ncorticotropin releasing hormone (CRH and glucocorticoid and to explore themechanismof the hippocampus invoIved in HPAaxisregulati on. Methods: The fornix was tran sect

3、ed to establish a animal model , ELISAwas used for detection of glucocorticoid concentrationson day 0, 4, 7 and 10 after fornix transaction.Immun ohistochemical method and Western Bio社ing wereresp ectively used for the exp ressi on of CRHn the hypo thalamus afterGlucocorticoid concentration wasincre

4、ased on the 7th day after fornix transection.The expression of CRHwas up扌以regulated ontran secti onand ad re nalectom yon.Con clusi ons: The hippocampus provides a n egative feedback to theHPAaxis through fornix , the glucocorticoid has a negative feedback effect on CRH.KEY WORDSFor nix tran secti o

5、n; For nix tran secti onandad re n alectomy;Corticotr op in releas ing horm one;Hypo thalamus應(yīng)激反應(yīng)是以下丘腦擬垂體擬腎上腺（hypothalamic擬pituitary擬.adrenal, HPA）軸的激活為核心的生理releasing hormone,CRH在HPA軸中發(fā)揮重要作用,控制著HP為由的興奮水平1。研究表明海馬對(duì)HPA軸有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，可能是因?yàn)閒ornixtran secti on and ad re n alectomy.Results;the 7th day after for

6、nix和心理反應(yīng)。應(yīng)激后促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotro pin海馬媒介穹窿對(duì)下丘腦室旁核產(chǎn)生了抑制作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn) 通過(guò)建立大鼠穹窿切斷模型，觀察到穹窿切斷7d后，下丘腦室旁核神經(jīng)元CRH的表達(dá)升高，10d升高顯著2, 3 O此結(jié)果提示我們，穹增多,HPA軸活動(dòng)增強(qiáng)。但是血中糖皮質(zhì)激素的濃度升高是否是HPA軸活動(dòng)增強(qiáng)的結(jié)果，這一點(diǎn)還未曾證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠穹窿切斷模型, 檢測(cè)糖皮質(zhì)激素濃度變化情況，以進(jìn)一步驗(yàn)證海馬是否媒介穹窿 對(duì)下丘腦 室旁核產(chǎn)生了抑制作用。 此外通過(guò)實(shí)施穹窿切斷術(shù)同時(shí)摘除其腎上腺， 觀 察CRH的表達(dá)變化，研究糖皮質(zhì)激素與CRH的關(guān)系，為 研究揭示應(yīng)激

7、 的變化機(jī)理提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1動(dòng)物及分組成年健康雄性Wistar大鼠90只，200220g,購(gòu)于中國(guó)醫(yī) 科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)，隨機(jī)分為12組，即穹窿切 斷0、4、7、Wd組、相應(yīng)假手術(shù)組和相應(yīng)正常組，每組5只，共60只，用于ELISA檢測(cè)。剩余大鼠隨機(jī)分為穹窿切斷并摘除腎上腺7d組、相應(yīng)假手術(shù)組和相應(yīng)正常組。每組10只，共30只，用于免疫組 織化學(xué)和免疫印 跡法各半。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1穹窿切斷動(dòng)物模型窿切斷后海馬對(duì)下丘腦室旁核的抑制作用減弱,室旁核合成CRH將大鼠用戊巴比妥麻醉后，固定于江灣IC型腦立體定位儀，常規(guī)消毒、剪毛，正中切開(kāi)頭皮，暴露出顱

8、骨，于前岡后1 5mm中線 外 左右1 0mm處，用電動(dòng)開(kāi)顱器鑿開(kāi)顱骨，切開(kāi)硬腦膜，自制的雙刃刀置 于上述部位的腦表面（相當(dāng)于穹窿部位）,續(xù)降刀6mm切斷穹窿，降刀 時(shí)間約1 mg假手術(shù)組降刀2mm（未切穹窿）,刀在腦中均 停留5mino清潔顱面，縫合頭皮，常規(guī)飼養(yǎng)，抗生素控制感染4。1.2.2穹窿切斷并摘除腎上腺模型建立穹窿切斷動(dòng)物模型后，將大鼠俯臥位固定于蛙板上。從最后胸椎處向后沿背部正中線做約2cm長(zhǎng)的皮膚切口。在腎前內(nèi)側(cè)脊柱下 方找 到淡黃色的腎上腺并摘除，同法摘除右側(cè)腎上腺（位置稍靠前），縫合肌肉和皮膚，并涂以碘酊。假手術(shù)組進(jìn)行與實(shí)驗(yàn)組相似的手術(shù)，但不摘除代替飲水5。1.3 ELIS

9、A檢測(cè)血清糖皮質(zhì)激素水平取穹窿切斷大鼠眼窩靜脈叢血液，每次米血0 5mL,消毒棉球壓迫眼球止血30S。采血后離心取血清，相應(yīng)反應(yīng)板孔中加入20卩L標(biāo) 準(zhǔn)品，20卩L血清標(biāo)本，每板孔再加入200卩L酶聯(lián)物，室溫60mino洗滌液洗滌反應(yīng)板，每孔加入100卩L顯色液，室溫溫育15mino每孔 加入100卩L終止液。輕輕混勻30s； 60min內(nèi)450nm處讀OD值，再換算成質(zhì)量濃度。腎上腺。術(shù)后保持室溫為2125C,以葡萄糖、生理鹽水1.4免疫組織化學(xué)SABC法顯色穹窿切斷并摘除腎上腺大鼠施心灌流、 固定， 用恒冷箱切片 機(jī)（型號(hào)Leica ）制作冷凍切片，厚14卩m 3%H2O2甲醇20minv

10、 0,03% TritonX擬100浸泡10min, 5% BSA封閉20min后，滴加CRH抗體（工作濃度為1:500）,陰性對(duì)照組 加0 01 mol/L PBS代替一抗，4C孵育過(guò)夜，滴加二抗IgG 37Cv 20min,滴加SABC37C、20min, DAB顯色，脫水， 透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS3X60, Japan）下觀察，攝片。1 5免疫印跡法取穹窿切斷并摘除腎上腺大鼠新鮮下丘腦組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,11000 r/min,取上清；每例標(biāo)本提取蛋白50卩g, 7.5%SDS以PAGE變性凝膠電泳，濃縮膠80V, 30min,分離膠120V, 9

11、0min：轉(zhuǎn)印，40V, 95min和100V, 120inin； TBS浸泡10min, 5%兌脂奶粉封閉60min, TTBS中洗2X 5min：TTBS洗2X5min, TBS洗1X Wmin,掃描膠片，Scion Image軟件分析。CRH-抗（工作濃度1 :1000）中孵育4C過(guò)夜；HRP標(biāo)記IgG（工作濃度1 : 1500）孵育2h,HRP： ECL法顯色,dH2O漂洗，1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以士S表示，用SPSS13.0軟件處理，采用方 差分析進(jìn)行兩兩比較，以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1 ELISA檢測(cè)結(jié)果ELISA結(jié)果表明穹窿切斷后0、4d,糖皮質(zhì)激素的濃度無(wú)明

12、顯變化，7d后糖皮質(zhì)激素濃度升高，Wd升高顯著(表1)。表1各 組大鼠血清糖皮質(zhì)激素的水平(略)2.2 CRH免疫組織化學(xué)反應(yīng)顯色結(jié)果正常組及假手術(shù)組CRH免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色斑塊狀，主要分布于室旁核神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。 穹窿切斷并摘除腎上腺組下丘 腦室旁 核神經(jīng)元CRH的陽(yáng)性表達(dá)(0,499 0,077 )較正常組(0.387 0.065 )、假手術(shù)組(0.379 0.082 )明顯增高，CRH免疫反應(yīng)的平均光密度值升高，細(xì)胞染色變深，(PV 0.05)(圖1)。2.3免疫印跡法結(jié)果免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下丘腦CRH的表達(dá)在穹窿切斷并摘除腎上腺組(91.21士8.73)與假手術(shù)組(43.83

13、4.16 )、正常組(39,72士3.48 )相比明顯升高(PV 0,05 )(圖2)。3討論CRH是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與機(jī)體的內(nèi)分泌、代謝、心血 管功能、神經(jīng)化學(xué)和行為反應(yīng)密切相關(guān)。CRH廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系 統(tǒng),HPA軸活動(dòng)的直接控制部位。應(yīng)激狀態(tài)下，室旁核分泌CRH經(jīng)正中隆但在應(yīng)激后僅在下丘腦室旁核表達(dá)增加6。下丘月兇室旁核是起、垂體門(mén)脈系統(tǒng)作用于垂體前葉細(xì)胞上高度表達(dá)的CRHR1 (CR的丨型受體)，刺激垂體前葉合成、分泌ACTH促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激 素，發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌功能7。研究表明海馬對(duì)HPA軸有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。但是從海馬到室旁核沒(méi)有直接的神經(jīng)投射，間接路徑都匯聚到穹窿，由

14、此可推斷海馬 對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)作用可能是媒介穹窿對(duì)下丘腦旁核產(chǎn)生了抑制作用。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠穹窿切斷的模型，觀察到穹窿切斷7d后,CRH的表達(dá)升高。提示穹窿切斷后，海馬對(duì)HPA軸的抑制作用 減弱， 室旁核合成CRH增多，HPA軸活動(dòng)增強(qiáng)，證明了海馬可能通過(guò) 穹窿對(duì) 室旁核發(fā)揮抑制作用。但是CRH表達(dá)升高，HPA軸活動(dòng)增強(qiáng)的最終結(jié)果 是糖皮質(zhì)激素的水平升高。為此，本實(shí)驗(yàn)在已有的研究基礎(chǔ) 上建立了大 鼠穹窿切斷的模型，檢測(cè)血中糖皮質(zhì)激素的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明穹窿切斷7d后，糖皮質(zhì)激素的濃度升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了海馬 通過(guò)穹窿對(duì)下丘腦室 旁核發(fā)揮抑制作用?，F(xiàn)將穹窿切斷的動(dòng)物并摘除腎上腺，即

15、在糖皮質(zhì)激素水平下 降的情況下，觀察CRH的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穹窿切斷并摘除腎上腺7d,CRH的表達(dá)升高。有研究表明當(dāng)糖皮質(zhì)激素的水平過(guò)高時(shí)，此激素的釋放8。綜上結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素對(duì)CRH有負(fù)調(diào)節(jié)的作用。本實(shí) 驗(yàn)為探討海馬抑制HPA軸的機(jī)制及研究應(yīng)激的變化機(jī)理提供了一定能通過(guò)在下丘腦室旁核及其上游水平的調(diào)節(jié)而有效抑制CRH的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【參考文獻(xiàn)】1 Preil J, Muller MB, Gesing A, et al. Regulation ofthe hypo thalamic pituitary jadre no cortical system in mice deficie nt

16、 forCRHeceptors 1 and 2 J . Endocrinology, 2001, 142 (11): 4946擬4955,2 Fang H, Hong L, Yanhui乙et al.hippoca扌以mpal corticosteroid receptors, as well as corticotroph in扌以releas ing horm one and vasopress in in the hy pothalamic paraventricular nucleus,in fornix transected ratsJ Neural Regeneration Rea

17、rch , 2009, 4:325擬332,3張彥慧，韓芳，石玉秀大鼠海馬神經(jīng)元核受體擬鹽皮質(zhì)激素受體于穹窿切斷后表達(dá)的變化J解剖學(xué)雜志，2008,31 (4): 522擬525,4張彥慧，石玉秀，符皎榮，等大鼠海馬神經(jīng)元核受體擬.糖皮質(zhì)激素受體在穹窿切斷同時(shí)摘除腎上腺后表達(dá)的變化J神經(jīng)解剖學(xué)雜 志，2010, 26 (2) : 161擬164,Expression of5張彥慧，符皎榮，陸平腎上腺切除后大鼠下丘腦室旁核MRGF表達(dá)變化的研究J海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008,4(2) : 0期107.6 Imaki T, Katsumata H, Miyata M, et al,Expressi on ofcorticotroph in releas ing horm one type 1 receptor in parave ntricular nuJ .Neuroendocrinology, 2001,73:293擬301.7Fang Han. Colocalizationreceptor and gluc