甘草酸修飾紫杉醇脂質體在小鼠體內組織分布研究1

1、甘草酸修飾紫杉醇脂質體在小鼠體內組織分布研究1    摘 要：研究甘草酸配體修飾紫杉醇脂質體(GLOST-PTX)在小鼠體內組織分布。采用薄膜分散法制備紫杉醇甘草酸受體脂質體，小鼠尾靜脈注射給藥，高效液相色譜檢測小鼠各組織中紫杉醇濃度，梯形法計算藥物在小鼠體內各組織的蓄積情況。結果顯示，GLOST-PTX 脂質體在肝臟的蓄積AUC 0 12 增加了31.76%，脾臟分布增加了13.32%，其它組織均有一定程度的減少。說明經甘草酸修飾后，載藥脂質體的體內的分布有所改變，藥物在肝和脾的分布得到提高。關鍵詞：甘草酸；紫杉醇；脂質體；組織分布1 引言甘草酸（gl

2、ycyrrhizin,GL）是甘草的主要成分之一，Negishi 在20 世紀90 年代初證實了大鼠肝細胞膜中含有大量甘草酸特異結合位點，甘草酸與該位點的結合呈受體特有的可飽和性、高度特異性1，一些研究結果也表明以甘草次酸或甘草酸修飾的載體材料具有趨肝性2-3，國內也有相關文獻報道用甘草酸作為肝靶向配體來修飾藥物載體，以提高藥物對肝臟的趨靶性，如用甘草酸表面修飾納米粒4-5。本課題組采取化學法合成甘草酸的脂肪長鏈修飾物（GLOST），并將其作為靶向配體鑲嵌于紫杉醇脂質體表面，制備得到甘草酸介導紫杉醇脂質體（GLOST-PTX 脂質體），相關內容在前述文章已作了報道。然而經甘草酸修飾后的藥物載體

3、對肝臟的靶向效果如何，還有待驗證。由此本文考察了GLOST-PTX 脂質體在小鼠體內的組織分布，對甘草酸修飾紫杉醇脂質體的靶向性進行了初步探討。2 材料與儀器2.1 儀器Dionex 高效液相色譜儀（P680 型泵，PDA-100 型檢測器，ASI-100 自動進樣器，美國戴安公司）；Niro NS1001L PANDA 高壓均質機（意大利Niro Soavi 公司）；RE-3000A 旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DS-1 高速組織搗碎機（上海標本模型廠）；十萬分之一電子天平（Sartorius）；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪豫華儀器廠）；JY96-超聲波細胞粉碎機（寧波新

4、芝科器研究所）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）。2.2 藥品與試劑甘草酸配體修飾物（GLOST 自制）；紫杉醇標準品（SIGMA公司）；紫杉醇(沈陽天峰生物工程技術有限公司，含量99.8%)，注射用卵磷脂（德國lipoid公司）；膽固醇（廣州市醫(yī)藥公司進口分裝）；Vit E（SIGMA公司）；肝素鈉（南京新飛生化制品有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純，其他藥品、試劑均為國產分析純。3 方法與結果3.1 脂質體的制備1本課題得到高等學校博士學科點專項科研基金(20060572012)和國家自然科學基金(30772790)的資助。稱取紫杉醇60mg 溶于適量磷酸緩沖液（PH=5.6），另取注射用豆

5、磷脂1.8g、膽固醇0.6g 及適量的磷脂酰甘油、水溶性維生素E 溶于5mL 乙醇中，置250mL 茄形瓶中，待完全溶解后，65旋轉薄膜蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去乙醇，在瓶壁上形成均勻的類脂薄膜。帶膜的茄形瓶減壓干燥8 小時，加70mL 磷酸緩沖液溶解，將GLOST 適量（用無水乙醇溶解）注入其中,探頭超聲水合20min，過0.22m 濾膜2 次，高壓均質二次（1200bar），即得GLOST-PTX脂質體。另取同處方量原輔料，不加靶向配體GLOST，按上述制備方法制得PTX 脂質體。3.2 給藥設計昆明小鼠40只，雌雄各半，體重(18±3)g，隨機分為2組，每組20只。分別尾靜脈注射PTX

6、脂質體和GLOST-PTX脂質體（5%葡萄糖注射液配為0.4g·L-1），注射劑量按計3mg·kg-1。給藥后0083、0.17、025、05、1、2、3、4、6、8、12h處死，取心、腦、肝、腎、脾、肺組織，精密稱定重量，備用。3.3 樣品處理3.3.1 血漿制備小鼠眼眶取血于5mL聚丙烯離心管中，肝素抗凝，3000rpm離心15min，精密吸取上清液0.5mL，置5mL聚丙烯離心管中，精密加入0.1mL的5%抗壞血酸檸檬酸鹽緩沖液（0.1mol·L-1，PH=3.0），貯于-20冰箱中，備用。3.3.2 器官勻漿制備取小鼠心、肝、脾、肺、腎，用生理鹽水洗滌去血

7、，濾紙吸干水分，精密稱定，加入0.L倍量的5%抗壞血酸檸檬酸鹽緩沖液（0.1mol·L-1，PH=3.0），剪碎，超聲波細胞粉碎機勻漿，3000 rpm離心15min，精密吸取器官勻漿0.5mL，按“3.3.1”項下處理。3.4 含量測定3.4.1 色譜條件色譜柱：Spherrisorb ODS2C18（50×4.6mm，5m）；流動相為乙腈-0.2mol·L-1醋酸銨-冰醋酸（60:3:1），檢測波長229nm，柱溫30；流速1.0mL·min-1，進樣量：20L。3.4.2 標準品溶液制備取紫杉醇標準品適量，精密稱定，加甲醇配成濃度為1.0mg

8、83;mL-1 的溶液，即得。3.4.3 內源性物質影響考察取空白小鼠血液放置數(shù)小時，離心（3,000rpm，4）30min，取上層血清0.5mL，加甲醇2mL，渦旋混合2min，離心（12,000rpm，4）10min，取出上清液，備用，另取加藥血清同法處理。分別用HPLC法測定。如圖1。結果顯示，在此色譜條件下，能有效避免內源性干擾。Negative serum HPLC spectra PTX liposmoes HPLC spectra圖1 內源性物質影響Figure 1 Impact of serum3.4.4 標準曲線制定血清藥物濃度 精密稱量PTX對照品，加入空白血清定容配成濃度

9、為0.1mg·mL-1對照品溶液，分別精密移取不同體積的含標準品血清，定容制得1.0、5.0、10.0、15.0、30.0、60.0g·ml-1的對照品血清溶液。分別精密量取血清液1.0mL加入乙腈4.0mL，在旋渦混合2min，離心（3000rpm，4）10min，立即倒出上清液，水浴蒸干后用乙腈定容為1.0mL，取20L注入色譜儀。以濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，得到線性方程A =6741.50C+0.9321，r=0.9991，線性范圍為1.030g·mL-1。臟器勻漿藥物濃度 精密稱量PTX對照品，加入空白臟器均漿液，定容配成濃度為0.1mg·

10、;mL-1對照品溶液，同前述方法處理，取20L注入色譜儀。以濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，得到線性方程A =6321.48C+0.85685，r= 0.9986，線性范圍為1.030g·mL-1。3.4.5 回收率試驗血清回收率 精密稱量PTX對照品適量，加入含藥血清定容為2.0mL，精密量取血清液1.0mL加入乙腈4.0mL，搖勻，用液相色譜儀測定含量，計算回收率,結果見表1。表1 血清回收率Table 1 Results PTX of recovery testing in serumSerial number recovery testing（%） Average RSD1

11、 97.252 98.623 102.364 101.625 98.3299.63% 2.23%臟器勻漿回收率 精密稱量PTX對照品適量，加入含藥臟器勻漿定容為2mL，精密量取組織勻漿液1.0mL加入乙腈4.0mL，搖勻，用液相色譜儀測定含量，計算回收率, 結果見表2。表2 臟器勻漿回收率Table 2 Results PTX of recovery testing in organ homogenateSerial number recovery testing（%） Average RSD1 99.322 101.633 102.374 96.855 97.5699.54% 2.43%由表

12、1,2 可見，PTX 在血清及器官勻漿中回收率良好。3.4.6 精密度實驗于日內、日間不同時間分別取空白血漿及組織勻漿取空白血漿2mL，分別精密加入PTX對照品液適量，配制成三種不同濃度的PTX生樣品，取20L注入液相色譜儀，計算日內及日間精密度。結果顯示，精密度較好。3.5 組織分布取給藥后血漿或器官勻漿液，加入水和乙腈混合液(水：乙腈=1：1)1mL，旋渦混合30s后，用3mL無水乙醚提取，振搖2min，3000r·min離心15min，取上層有機溶劑于40浴上氮氣流吹干，用0.1mL乙腈溶解，取20L注入液相色譜儀，測定藥物含量，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析6。梯形法計算

13、PTX在各組織的AUC 0 12 比較蓄積情況結果，見表3、4、5。表3 靜注PTX 脂質體后不同時間點PTX 的小鼠各組織血藥濃度Table 3 0-12h PTX density of Organize by i.v. PTX liposomes表4 靜注GLOST-PTX 脂質體后不同時間點PTX 的小鼠各組織濃度Table 4 0-12h PTX density of Organize by i.v. GLOST-PTX liposomes表5 各組織中藥物的蓄積Table 5 AUC 0 12 of different organize結果表明：在肝部的蓄積AUC 0 12 修飾后的

14、PTX增加了31.76%，脾臟分布增加了13.32%，其它組織均有一定程度的減少。4 結論本研究將被動靶向運轉的脂質體載體研制成甘草酸修飾的主動靶向脂質體并以紫杉醇為模型藥物，制成較為穩(wěn)定的液體脂質體?；驹硎峭ㄟ^化學合成反應制得甘草酸的脂肪長鏈修飾物，將其接載于包埋成功的甘草酸納米脂質體上，根據(jù)甘草酸與肝表面甘草酸受體的主動的特異性結合，及大分子脂質物被動靶向集中分布于肝及淋巴各級系統(tǒng)的原理，同時利用甘草酸具有保肝，解毒、扶正的活性，形成同時具有脂質被動靶向和甘草酸肝部受體主動靶向的新型抗肝癌脂質體制質，使本制劑達到提高病灶部位給藥濃度，降低抗腫瘤藥物在肝部毒副作用而達到特異性主動靶向、緩釋、靶向的臨床用藥要求。小鼠體內分布實驗結果顯示，經甘草酸衍生物（GLOST）修飾后的紫杉醇脂質體在肝臟的蓄積AUC 0 12 增加了31.76%，脾臟分布增加了13.32%，其它組織均有一定程度的減少。說明經接載甘草酸修飾后，紫杉醇脂