大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織STAT3變化的免疫組織化學(xué)研究

1、    大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織STAT3變化的 免疫組織化學(xué)研究        【摘要】目的探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT)3在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)及其與缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷的關(guān)系。方法用ABC免疫組化方法觀察大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織中的STAT3蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞分布。結(jié)果正常和假手術(shù)大鼠腦內(nèi)以及腦缺血后的非缺血半球腦組織中未發(fā)現(xiàn)有STAT3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，腦缺血再灌注損傷后12小時(shí)在栓塞側(cè)梗死區(qū)可見(jiàn)少量STAT3免疫陽(yáng)性細(xì)胞，

2、24小時(shí)后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多達(dá)高峰，在缺血側(cè)紋狀體和缺血皮質(zhì)周邊區(qū)表達(dá)最明顯，1周后梗死周邊區(qū)少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞仍有陽(yáng)性表達(dá)。差異有顯著意義（P<0.01）。結(jié)論STAT3的活化及超量表達(dá)可能介導(dǎo)了缺血神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，并參與了腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損傷與修復(fù)的病理生理過(guò)程?！娟P(guān)鍵詞】STAT3腦缺血再灌注大鼠 Immunohistochemical study on STAT3 change after focal cerebral ischemic reperfusive injury in ratsXie Huifang, Liu Zhenhua,Zhu Liyuan.(Department

3、 of Neurology, Zhujiang Hospital,the First Military Medical University, Guangzhou 510282)【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of singal transducers and activators of transcription(STAT3) during focal cerebral ischemic reperfusive injury in rats and the relationship between ischemic neuronal

4、damage and it.MethodsUsing immunohistochemical method of avidinbiotin peroxidase complex (ABC) we observed the distribution of positive cells in STAT3 protein immunoreaction after focal cerebral ischemic reperfusive injury in rats.ResultsSTAT3 immunoreactive positive cells were not found in the cort

5、ex and striatum of normal and sham-operative rat brains and nonischemic hemisphere brain after cerebral ischemia,small amount of STAT3 immunity positive cells were induced in the embolism la-teral infarction area 12 h after reperfusive injury,and peaked after 24 h,especially in ischemic lateral stri

6、atum and around cortex,small number of nerve cells in around infarction still showed positive expression after one week.The difference had remarkable significance(P<0.01).ConclusionThe expressions of STAT3 activation and overload might indicate the transmission course in ischemic nerve cell signa

7、l,and played a role in cerebral ischemic nerve cell injury and pathophysiological process of renovation.【Key words】STAT3Cerebral ischemic reperfusionRats有文獻(xiàn)報(bào)道，腦缺血時(shí)白細(xì)胞介素-6(IL-6)及IL-6受體(IL-6R)表達(dá)增加，但與IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有密切關(guān)系的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）家族中的STAT3在腦缺血時(shí)如何表達(dá)至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究用免疫組化方法，觀察了大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織中STAT3蛋白的表達(dá)變化及其與

8、缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性Sprague-Dawley大鼠，體重280310 g，由第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物研究所提供。動(dòng)物隨機(jī)分為8組，缺血60分鐘再灌注1小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、148小時(shí)和正常組及假手術(shù)對(duì)照組，每組3只鼠。1.2動(dòng)物模型制作用10%水合氯醛0.35 ml/100 g體重，腹腔注射麻醉，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，頸部左旁正中切開(kāi) ，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)，在翼腭動(dòng)脈起始部置一血管夾，結(jié)扎、切斷ECA，于ECA殘斷的起始部剪一0.2 mm小口，將已經(jīng)消毒的4-0單絲尼龍線

9、由ECA殘斷插入使之由ECA經(jīng)CCA分叉沿ICA入顱，至大腦前動(dòng)脈，插入深度由分叉部計(jì)17.5 mm左右，缺血60分鐘，抽出尼龍線，于再灌注后1小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)、148小時(shí)處死動(dòng)物取材。 假手術(shù)對(duì)照組只是不插入單絲尼龍線，其它步驟同手術(shù)組。10%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，開(kāi)胸經(jīng)左心室至主動(dòng)脈插管，先快速灌注生理鹽水100 ml左右，然后灌注4用0.1 mol/L磷酸液配制的4%多聚甲醛400600 ml，將腦取出后在上述固定液中固定12小時(shí)，再放入含30%蔗糖的0.1 mol/L磷酸緩沖液中，腦塊下沉后，恒冷箱切片機(jī)冠狀連續(xù)切片，片厚10 m，

10、然而按ABC法進(jìn)行STAT3免疫組織化學(xué)染色。1.3STAT3免疫組織化學(xué)反應(yīng)STAT3免疫組化的主要步驟為：(1)0.3%甲醇過(guò)氧化氫孵育30分鐘清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；(2)封閉用正常馬血清室溫孵育1小時(shí)；(3)小鼠STAT3單抗(1500)4過(guò)夜；(4)生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體室溫放置1小時(shí)；(5)AB復(fù)合物(1:100,Vector)室溫反應(yīng)1小時(shí)，用0.02%DAB和0.06%過(guò)氧化氫顯色15分鐘，PBS終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，經(jīng)脫水、透明和封片后光鏡觀察，以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS洗3×5分鐘。陰性對(duì)照用正常馬血清代替抗，各步驟同上。鼠抗STAT3單克隆

11、抗體為日本Transduction Laboratories產(chǎn)品，ABC試劑盒為Vector公司產(chǎn)品。其余試劑均為分析純。1.4結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在40×10倍的光鏡視野下，分別對(duì)相鄰切片的STAT3免疫陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每只鼠各取3張切片。全部數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，統(tǒng)計(jì)處理用方差分析和t檢驗(yàn)。2結(jié)果正常組、假手術(shù)組、腦缺血60分鐘再灌注1小時(shí)組、6小時(shí)組兩側(cè)大腦半球均未見(jiàn)STAT3蛋白陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)，腦缺血再灌注損傷后12小時(shí)在栓塞側(cè)梗死區(qū)可見(jiàn)少量STAT3免疫陽(yáng)性細(xì)胞(8.3±4.1個(gè)/每視野)，24小時(shí)后在缺血側(cè)紋狀體和缺血皮質(zhì)周邊、額頂

12、皮質(zhì)免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多并達(dá)高峰(25.8±3.7個(gè)/每視野)，免疫陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞漿染成棕褐色，再灌注7天梗死周邊區(qū)少數(shù)細(xì)胞形態(tài)尚完整的神經(jīng)細(xì)胞仍有持續(xù)表達(dá)(14±3.6個(gè)/每視野)，差異有顯著意義（P<0.01）。3討論細(xì)胞因子作為一種細(xì)胞間信息傳遞因子愈來(lái)愈受到關(guān)注，近年來(lái)研究表明1，2 ，炎性細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、TNF）在腦缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡的病理機(jī)理中發(fā)揮重要的作用，其中IL-6水平的變化已引起人們的關(guān)注，腦缺血后神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞均能快速合成并誘導(dǎo)IL-6及IL-6R的表達(dá)。IL-6可以通過(guò)其受體活化細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)蛋白分子，從而實(shí)現(xiàn)IL

13、-6反應(yīng)基因的誘導(dǎo)表達(dá)，新近研究發(fā)現(xiàn)IL-6和IL-6R復(fù)合物結(jié)合于gp130分子的胞外區(qū)，迅速引起gp130的二聚體，這使得與其胞漿區(qū)box1偶聯(lián)的Jak激酶分子相互接近，并通過(guò)交與Tyr磷酸化作用而活化。活化的Jak激酶催化gp130上的Tyr殘基發(fā)生磷酸化，進(jìn)而形成STAT3和/或STAT1進(jìn)入gp130受體復(fù)合物的“停泊位點(diǎn)”，STAT3或STAT1由其SH2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)結(jié)合gp130，并由Jak激酶催化其C端的Tyr殘基發(fā)生磷酸化而活化；活化的STAT分子離開(kāi)gp130并借助于磷酸Tyr的SH2結(jié)構(gòu)域的Arg之間的作用形成同/異二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)特異的靶基因位點(diǎn)結(jié)合從而激活目的基

14、因的表達(dá)3。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠腦組織中未發(fā)現(xiàn)STAT3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，這可能與STAT3在正常神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)較低有關(guān)，腦缺血再灌注損傷后12小時(shí)在栓塞側(cè)梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞可見(jiàn)少量STAT3蛋白陽(yáng)性表達(dá)，24小時(shí)時(shí)陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，在缺血側(cè)紋狀體和缺血皮質(zhì)周邊區(qū)表達(dá)最明顯，1周后梗死周邊區(qū)少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞仍有陽(yáng)性表達(dá)。STAT3在受損神經(jīng)細(xì)胞中的超量表達(dá)，提示腦缺血再灌注損傷可誘發(fā)STAT3蛋白的表達(dá)，至于腦缺血后STAT3蛋白的活化及高表達(dá)的原因目前尚不太清楚，我們認(rèn)為可能與腦缺血時(shí)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞快速合成并誘導(dǎo)IL-6及IL-6R的表達(dá)，IL-6與神經(jīng)細(xì)胞表面的IL-6R結(jié)合后，激活JAK-S

15、TAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致STAT3的活化及高表達(dá)。STAT3蛋白在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的延遲性高表達(dá)，表明STAT3可能與腦缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞生存與凋亡的基因調(diào)控過(guò)程有關(guān)。目前有關(guān)STAT3在細(xì)胞死亡中的作用尚不十分清楚，在不同的細(xì)胞體系中，STAT3蛋白的活化具有介導(dǎo)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡雙重作用。Minami等4，5研究發(fā)現(xiàn)STAT3在IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中扮演重要的角色。而在某些情況下STAT3則可能通過(guò)誘導(dǎo)bcl-2、bcl-xl等基因的表達(dá)而具有抗細(xì)胞凋亡的作用6，甚至在許多腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，有學(xué)者認(rèn)為它是一種癌基因7。那么，腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)STAT3活化，通過(guò)調(diào)控何種目

16、的基因，其具體的作用機(jī)理又是如何？均有待進(jìn)一步研究。謝惠芳（廣州第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科510282）劉振華（廣州第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科510282）朱利元（廣州第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科510282）參 考 文 獻(xiàn)1，Saito K, Suyama K, Nishida K, et al. Early increases in TNF-2,IL-6,and IL-1 levels following transient cerebral ischemia in gerbil brain. Neurosci Lett,1996,206:1462，Tarkowski E, Rosen

17、gren L, Blomstrand C,et al. Early intrathecal production of interleukin-6 predicts the size of brain lesion in stroke. Stroke,1995,26:13933，Taga T, Kishimoto T. Gp130 and the interleukin-6 family of cytokines. Annu Rev Immunol, 1997, 15:7974，Minami M, Inone M, Wei S,et al. STAT3 activation is a critical step in gp130-mediated terminal differentiation and growth arrest of a myeloid cell line. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93:39635，Oritani K,Tomiyama Y,Kincade PW,et al. Both STAT3-activation and STAT3-independent Bcl2 downregulation are important for interleuki