Aβ1-40腦內(nèi)注射對大鼠海馬超氧化物歧化酶丙二醛的影響及通

1、A1-40腦內(nèi)注射對大鼠海馬超氧化物歧化酶丙二醛的影響及通絡(luò)救腦口服液的干預(yù)作用                作者：張曉杰，張春慶，胡南，宮國良，李澎濤【摘要】  目的觀察通絡(luò)救腦口服液對-淀粉樣蛋白1 - 40 (A1-40 )誘導(dǎo)的AD模型大鼠海馬SOD活性和MDA蛋白表達(dá)的影響。方法選用140只SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白對照組、假手術(shù)組、模型組、鹽酸多奈哌齊組、通絡(luò)救腦口服液各劑量組(12，24，48 mg?kg-1?d-1)共7

2、組，每組20只。采用海馬立體定向注射凝聚態(tài)A1 - 40建立老年性癡呆(Alzheimer''''s disease， AD)動物模型。藥物干預(yù)4周，第5周應(yīng)用分光光度法檢測大鼠大腦海馬組織SOD、MDA蛋白的表達(dá)。結(jié)果與空白對照組比較，模型組SOD活性明顯降低(P<0.05)，而MDA含量明顯升高(P<0.05);與模型組比較，鹽酸多萘哌齊組、通絡(luò)救腦口服液各劑量組SOD活性明顯升高(P<0.05)，而MDA含量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論通絡(luò)救腦口服液通過上調(diào)SOD的活性和抑制MDA的表達(dá)而發(fā)揮其抗氧化治療老年性癡呆的作用。 【關(guān)鍵

3、詞】  阿爾茨海默氏病; 通絡(luò)救腦口服液; 超氧化物歧化酶; 丙二醛Abstract：ObjectiveTo observe the effect of TLJN Oral Solution on protein SOD, MDA expression in brain tissue of amyloid-1-40 injection into Hippocampus-induced experimental AD rats in vivo. Methods140 SD rats were enrolled in the study, and they were equally ra

4、ndomly divided into blank control group,sham control group, negative control group, positive control group and experiment group(12,24,48 mg?kg-1?d-1).A rat model of AD was induced by amyloid-1-40 sterotaxis injection into the bilateral hippocaupa. All rats were sacrificed in the 5th week after treat

5、ment for 4 weeks. The total activity of SOD and level of MDA in brain tissue were detected by ultraviolet-spectrophotometry.ResultsThe SOD activity was decreased in model groups (P<0.05)compared with the sham group and MDA level was increased. In experiment groups the SOD activity was increased a

6、nd MDA content was reduced compared with the model group (P<0.05).ConclusionTLJN Oral Solution can up-regulate expression of SOD and down-regulate expression of MDA. TLJN Oral Solution can inhibit the incidents of Alzheimer''''s disease by antioxidative effect.Key words：Alzheimer&

7、#39;'''s disease; TLJN Oral Solution; SOD; MDA老年性癡呆(Alzheimer''''s disease ,AD)又稱阿爾茨海默病, 是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其特征性病理變化是患者腦內(nèi)的神經(jīng)炎性斑，它是細(xì)胞外-淀粉樣蛋白(-amyloid,A)沉積而形成的1。阿爾茨海默病是一類多病因疾病，研究表明，自由基損傷和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致阿爾茨海默病大腦神經(jīng)元損傷的重要原因2，血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malon

8、-dialdehyde,MDA) 與阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系3。本實(shí)驗(yàn)采用大腦海馬立體定向注射凝聚態(tài)A1-40的方法建立AD大鼠模型，并用通絡(luò)救腦口服液進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察通絡(luò)救腦口服液對AD模型大鼠海馬SOD活性和MDA蛋白表達(dá)的影響，以探討通絡(luò)救腦口服液對AD的防治作用。1 材料與儀器1.1 動物 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠140只，鼠齡812周，體質(zhì)量(280±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2002-0003。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對照組、假手術(shù)組、模型組、鹽酸多奈哌齊組和通絡(luò)救腦口服液3個劑量組共

9、7組，每組20只。1.2 藥物 通絡(luò)救腦口服液，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制備。鹽酸多奈哌齊片由法國PFIZER PGM公司制造，產(chǎn)品批號：5136903。A1-40為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。A1-40使用前用無菌生理鹽水稀釋成10 g?l-1，37孵育1周，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的A。1.3 試劑 SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供;其它試均為國產(chǎn)分析純。1.4 儀器 UV-2550型分光光度計(jì)(日本島津公司);MR1812高速冷凍離心機(jī)(法國Jouan);MDF-492超低溫冰箱(日本三洋公司);AE-240型電子天平(梅特勒-托利

10、多儀器有限公司)。2 方法2.1 動物模型的制作 實(shí)驗(yàn)大鼠1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，立體定向儀固定頭部，備皮消毒，沿顱頂中線作2 cm切口，分離骨膜暴露頭骨，于前囟向后3.0 mm，中線左右各旁開2.2 mm，用牙科鉆打開顱骨，垂直進(jìn)微量進(jìn)樣器針2.8 mm，將1 l溶液緩慢注入，注射時(shí)間為5 mm，留針5 min。模型組、鹽酸多奈哌齊組、通絡(luò)救腦口服液各劑量組左右側(cè)海馬各注射1 l A1-40(10 g)溶液，假手術(shù)組注射1l生理鹽水。2.2 給藥方法 造模后3天開始給藥，鹽酸多奈哌齊組按0.33 mg?kg-1?d-1，各通絡(luò)救腦口服液組按12，24，48 mg?kg-1?

11、d-1給藥，1次/d灌胃，其余3組給等體積生理鹽水，共4周。2.3 SOD活性和MDA含量的測定 行為學(xué)測試后，大鼠斷頭處死，在冰上迅速分離出海馬，用冰生理鹽水沖凈其表面血跡，濾紙拭干后，電子天平稱重。按照試劑盒測定SOD活性和MDA含量。2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13. 0 軟件包進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以± s表示，統(tǒng)計(jì)分析采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，組間兩兩比較運(yùn)用SNK檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。3 結(jié)果3.1 通絡(luò)救腦口服液對AD大鼠海馬SOD活性的影響結(jié)果見圖1。與模型組比較，*P<0.05圖1 各組大鼠海馬SOD活性比較(±s，n=7

12、)模型組海馬SOD活性(52.43±3.25)較空白對照組(69.86±6.82)明顯降低(P<0.05);通絡(luò)救腦口服液各劑量組(12，24，48 mg?kg-1?d-1)SOD活性分別為(61.48±3.05)，(64.04±4.64)，(66.99±2.75)，較模型組升高(P<0.05);通絡(luò)救腦口服液各劑量組SOD活性與鹽酸多奈哌齊組SOD活性(65.29±4.37)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3.2 通絡(luò)救腦口服液對AD大鼠海馬MDA蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖2。與模型組比較，*P<0.05

13、;與鹽酸多奈哌齊組比較，# P<0.05圖2 各組大鼠腦組織中MDA含量比較(±s，n=7)模型組海馬MDA含量(9.09±0.41)明顯高于空白對照組(5.37±0.65)，P<0.05;通絡(luò)救腦口服液各劑量組(12，24，48mg?kg-1d-1)MDA含量分別為(5.71±0.58)，(6.39±0.38)，(7.12±0.29)較模型組明顯降低(P<0.05);通絡(luò)救腦口服液中劑量組和低劑量組MDA含量明顯低于鹽酸多奈哌齊組MDA含量(6.95±0.17)，P<0.05。4 討論阿爾茨海默病嚴(yán)

14、重威脅著人類健康，已成為繼心血管疾病、癌癥、中風(fēng)之后的第四大死亡原因4，尋找有效的AD防治方法已成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的研究課題。研究證實(shí)5,6，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)與阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。人體衰老后，體內(nèi)氧自由基水平增加，清除能力減退，在體內(nèi)大量聚積，過多的氧自由基可與細(xì)胞膜中游離或結(jié)合狀態(tài)的不飽和脂肪酸發(fā)生有害的過氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物-MDA的細(xì)胞毒作用，是導(dǎo)致AD神經(jīng)元變性壞死的重要原因7。研究證實(shí)8，AD模型鼠腦中MDA含量明顯升高，高水平的MDA經(jīng)常與神經(jīng)元纖維纏結(jié)及老年斑伴隨出現(xiàn)。機(jī)體的抗氧化能力與氧化能力之間保持著動態(tài)平衡，若自由基產(chǎn)生過多或抗氧化能力下降，大量的氧

15、自由基可直接損傷細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體及細(xì)胞DNA等結(jié)構(gòu)，促進(jìn)機(jī)體器官老化、功能喪失，甚至組織、器官的衰亡9。體內(nèi)的SOD可有效清除自由基，減輕組織損傷，作為機(jī)體防御自由基損傷的第一關(guān)10。臨床研究證實(shí)，阿爾茨海默病患者血清中SOD活性明顯降低11，抗氧化有治療老年癡呆的作用，通過消除活性氧或阻止其形成，以延緩、阻止神經(jīng)細(xì)胞的退行性變化12。SOD是體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶，檢測其活性可探討機(jī)體清除自由基、抗氧化的能力。MDA是生物膜中的多不飽和脂肪酸經(jīng)活性氧自由基破壞產(chǎn)生的終產(chǎn)物，檢測其水平可觀察機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度及細(xì)胞損傷程度。本研究通過觀察通絡(luò)救腦口服液對A1-40 誘導(dǎo)的AD模型大鼠S

16、OD、MDA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，AD模型大鼠SOD活力降低，MDA含量升高，而通絡(luò)救腦口服液能上調(diào)SOD的活性和抑制MDA的表達(dá)。提示通絡(luò)救腦口服液具有加快體內(nèi)自由基的清除，對抗自由基所致的氧化防御系統(tǒng)受損和脂質(zhì)過氧化水平升高的作用，保護(hù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到防治AD的目的。但中、低劑量組通絡(luò)救腦口服液抗氧化效果明顯好于高劑量組，出現(xiàn)此種現(xiàn)象的原因可能是中、低劑量藥物效應(yīng)已達(dá)最大，高劑量反而療效降低。為明確量效關(guān)系，確定MC的最佳治療劑量，有必要降低藥物劑量，再次進(jìn)行研究。【參考文獻(xiàn)】  1 Rabano A, Jimenez-Huete A, Acevedo B, et

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