GM-CSF基因修飾的卵巢癌細(xì)胞NuTu-19GM-CSF的構(gòu)建

1、GM-CSF基因修飾的卵巢癌細(xì)胞NuTu-19/GM-CSF的構(gòu)建    作者：李奇靈,王英,王運(yùn)萍,馮彩霞,高尚風(fēng)作者單位：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安                                &#

2、160;                    【摘要】目的 構(gòu)建能分泌表達(dá)粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌細(xì)胞NuTu-19/GM-CSF。方法 將T-h GM-CSF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌中,篩選出耐藥性單克隆菌落送測序。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出GM-CSF目的基因片段，將PCR產(chǎn)物連入pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴(kuò)增，用SDS堿裂解法提取Teasy-GM-CSF重

3、組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切Teasy-GM-CSF重組載體，連入經(jīng)相同酶酶切的pLXSN反轉(zhuǎn)錄病毒載體中。用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染PA317包裝細(xì)胞系進(jìn)行病毒包裝，用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選感染成功的NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)和ELISA法檢測NuTu-19/GM-CSF分泌表達(dá)GM-CSF蛋白的情況。結(jié)果 T-h GM-CSF重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank Accession#：NM_000758基因序列對比后確定為人類GM-CSF基因編碼序列；PCR產(chǎn)物酶切電泳在Mark 400-500 bp中有一條帶，符合GM-CSF基因序列長度

4、；重組Teasy-GM-CSF質(zhì)粒用EcoR、BamH限制性內(nèi)切酶酶切后，電泳鑒定在400-500 bp之間有一目的條帶，重組反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLGM-CSFSN酶切電泳有目的條帶；G418加壓篩選感染后的NuTu-19細(xì)胞，14 d后慢慢形成單克隆繼續(xù)生長；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到感染成功的NuTu-19細(xì)胞膜表面有明顯的棕褐色顆粒沉淀，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GM-CSF的質(zhì)量濃度為150 pg/mL。結(jié)論 成功構(gòu)建了能分泌表達(dá)人GM-CSF蛋白的卵巢癌細(xì)胞NuTu-19/GM-CSF，為以后研究卵巢癌免疫治療提供必備、有效、可靠的工具基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  NuTu-19細(xì)胞 粒

5、細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子 卵巢腫瘤 免疫治療 Construction of ovarian cancer cell NuTu-19/GM-CSFgenetically modified by GM-CSF Li Qiling, Wang Ying, Wang Yunping, Feng Caixia, Gao Shangfeng (Department of Gynecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, Chi

6、na) ABSTRACT: Objective  To construct NuTu-19/GM-CSF ovarian cancer cells which can secrete and express granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Methods  The T-h GM-CSF recombinant plasmid was transformed into competent Top109 Bacillus colis and the positive colonies were

7、 cultivated in soft agar medium. The T-h GM-CSF recombinant plasmid was used as models to amplify GM-CSF gene fragment by PCR. The certain fragment was linked with the pGEM-T easy vector and transformed into Top109 bacillus coil. SDS alkaline lysis was used to get T easy-GM-CSF recombinant plasmid w

8、ith pLXSN retrovirus vector cut by the same enzymes. The pseudotype virus was packed after transfecting PA317 cells using calcium phosphate precipitation. The supernate fluid which contained virus to infect NuTu-19 cells was saved. The positive cells were harvested through pressurizing selected by G

9、418. The GM-CSF protein secreted by NuTu-19/GM-CSF cells was tested by immunocytochemistry and ELISA. Results  T-h-GM-CSF included the human GM-CSF gene fragment which contained 435 bp and signal peptide coding region, compared with the sequence of Genebank Accession#: NM-000758. Production of

10、PCR was between 400 bp and 500 bp in the agarose electrophoresis, and had the same length with hGM-CSF gene. There was an electrophoretic strap between 400 bp and 500 bp and the sequence of the cutting fragment was completely correct after cutting T easy-GM-CSF recombinant plasmid by EcoR and BamH e

11、nzymes. It showed that the amplification ofthe GM-CSF gene fragment and the connection with T easy vector were successful. There was still the same strap between 400 bp and 500 bp in the agarose electrophoresis of pLGM-CSFSN after being cut by EcoR and BamH enzymes. The infected NuTu-19/GM-CSF cells

12、 cultivated in medium containing G418 continued to grow in the forms of monoclone 14 days later. There were some visible granules on the surface of the cellular membrane. The amount of GM-CSF in suspent liquid of cells culture was 150 pg/mL tested by ELISA. Conclusion  The construction of NuTu-

13、19/GM-CSF which can secret and express GM-CSF protein is successful, and offers effective and necessary basis for future study on ovarian cancer immunotherapy. KEY WORDS: NuTu-19 cell; granulocyte-macrophage colony-stimalating factor (GM-CSF); ovarian cancer; immunotherapy 卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,其主要特點(diǎn)是

14、隱蔽性高，臨床不易被發(fā)現(xiàn)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。近20年來國際婦產(chǎn)聯(lián)盟(FIGO)提出-期卵巢癌患者5年生存率一直徘徊在15%-30%，病死率高居婦科腫瘤首位，其根本原因在于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在過去的20多年內(nèi)，免疫治療是繼手術(shù)、放療、化療外的又一大腫瘤輔助療法。我們利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了能分泌表達(dá)人粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白的大鼠卵巢癌細(xì)胞NuTu-19/GM-CSF，為其用于卵巢癌免疫治療研究打好基礎(chǔ)。 1  材料與方法 1.1  材料 原發(fā)性大鼠卵巢上皮性腺癌NuTu-19細(xì)胞由原華西醫(yī)科大學(xué)王和教授惠贈本室保存。T-h GM-CSF重組質(zhì)粒由中國醫(yī)學(xué)科

15、學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院陳松森教授饋贈。TOP109細(xì)菌由西安華廣生物有限公司提供，由本室保存，包裝細(xì)胞系PA317細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN購于美國Colontech公司，pGEM-T easy載體購于美國Promega公司。 1.2  試劑 Taq DNA聚合酶及dNTPs、T4 DNA連接酶均為立陶宛Fermentas MBI公司。RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，EcoR、BamH限制性內(nèi)切酶購于華美生物有限公司，兔抗人GM-CSF多克隆抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品，山羊抗兔二抗為美國Jacksonimmuno公司產(chǎn)品，ELIS

16、A檢測試劑盒購于北京中昊時代生物技術(shù)中心。 1.3  實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1  含有目的片段的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)造 將T-h GM-CSF重組載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)TOP109大腸桿菌中，在Amp+瓊脂培養(yǎng)基中篩選出抗藥性單克隆，擴(kuò)增、測序鑒定后，以此載體為模板設(shè)計引物，采用PCR方法擴(kuò)增出GM-CSF編碼區(qū)。引物為：正向引物F鏈為5-CGAATTCATGTGGCTGCAGAGCCAGC；反向引物R鏈為5-CGGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC，并分別引進(jìn)EcoR酶BamH酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入pGEM-Teasy載體中，用相同方法篩選出單克隆擴(kuò)增后再次酶切電泳送測

17、序鑒定。鑒定正確后用EcoR和BamH酶切Teasy-GM-CSF重組質(zhì)粒，切出GM-CSF目的基因連入經(jīng)相同酶酶切后的反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN中，酶切電泳鑒定后大量擴(kuò)增，制備重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLGM-CSFSN重組質(zhì)粒。 1.3.2  細(xì)胞培養(yǎng)及條件 PA317細(xì)胞、NuTu-19細(xì)胞均用含100 mL/L胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基于37 50 mL/L CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 1.3.3  磷酸鈣沉淀法包裝病毒 PA317細(xì)胞傳代，在PA317細(xì)胞80%成片時棄上清液后加入新鮮培養(yǎng)液5 mL，后緩慢加入轉(zhuǎn)染液500 L，輕輕混勻后置37 50 mL/L C

18、O2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)變模糊，胞膜胞內(nèi)可見細(xì)小顆粒時換液為100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，3 d后收病毒液。 1.3.4  G418最佳藥物濃度的選擇 取6孔板加入未經(jīng)轉(zhuǎn)染的NuTu-19細(xì)胞懸液(約1 000 cell/mL)，培養(yǎng)6 h后依次分別加入含有G418的培養(yǎng)液,質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、600、800 g/mL培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，3-5 d換液1次，14 d后確定最佳篩選濃度。 1.3.5  制備GM-CSF修飾的NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞 選對數(shù)生長期貼壁良好的NuTu-19細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染

19、。細(xì)胞內(nèi)加入5 mL含10 g/L polybrene病毒液輕輕混勻后，置37 50 mL/L CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6 h后換液，反復(fù)轉(zhuǎn)染5次后換液培養(yǎng)。后加入G418 100 g/L，長滿培養(yǎng)瓶壁后撤去G418。 1.3.6  免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞分泌表達(dá)GM-CSF蛋白 分2組：A組為未轉(zhuǎn)染的NuTu-19細(xì)胞，B組為轉(zhuǎn)染的NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞，丙酮固定30 min，7.5 mL/L H2O2-PBS液37 孵育30 min后用PBS清洗。50 mL/L TritonX-100 37 下孵育30 min后再次PBS洗3遍，滴加山

20、羊血清，室溫下孵育20 min后傾去殘留血清，滴加1200稀釋后的大鼠抗人GM-CSF一抗，37 下置濕盒內(nèi)60 min后用PBS輕輕沖洗3次。滴加抗兔二抗(11 000稀釋)室溫下孵育2 h后，滴加新鮮配制的0.6 g/L DAB顯色液，室溫下濕盒內(nèi)放置20 min后，用自來水洗5 min后顯微鏡下攝片。 1.3.7  ELISA法檢測NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞分泌表達(dá)GM-CSF蛋白 設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8個，以未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液作為空白對照，以反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液為陰性對照，每個樣本做3個復(fù)孔，測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清液中GM-CSF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果用Bi

21、o-Rad Model680 Microplatereader于波長490 nm處測定吸光度(A)值表示，結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組/陰性對照組2.1判為陽性。 2  結(jié)果 2.1  含有目的片段的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)造 T-h GM-CSF重組質(zhì)粒送測序結(jié)果與GenBank Accession#：NM-000758基因序列對比后確定為人類GM-CSF基因編碼序列，從ATG-TGA共435個堿基對，含有信號肽編碼區(qū)。T-h GM-CSF質(zhì)粒序列正確。PCR擴(kuò)增出目的片段經(jīng)透析膜回收法回收，10 g/L瓊脂糖電泳后可見一條帶在400 bp-500 bp之間(圖1)；后連入T-easy載體中用

22、EcoR和BamH酶切，鑒定結(jié)果有目的片段切出(圖2)，遂再次送測序，經(jīng)軟件分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為GM-CSF目的片段，且成功連入T-easy載體中。用EcoR和BamH酶切出目的片段連入經(jīng)相同酶切的pLXSN反轉(zhuǎn)錄載體擴(kuò)增后酶切鑒定，可見目的片段切出(圖3)。 2.2  轉(zhuǎn)染結(jié)果 PA317細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第2天細(xì)胞部分死亡，3 d后收病毒上清液保存于-20 冰箱內(nèi)。 2.3  G418最佳藥物濃度的選擇   G418濃度篩選第8天時50、100 g/L培養(yǎng)孔內(nèi)部分細(xì)胞死亡，200 g/L及以上孔內(nèi)大部分細(xì)胞死亡，14 d后100 g/L孔內(nèi)細(xì)胞全部死亡，50 g/L孔

23、內(nèi)細(xì)胞尚有一部分細(xì)胞貼壁存活，其余孔14 d前全部死亡，遂選100 g/L質(zhì)量濃度為G418篩選抗性NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞的篩選濃度。 2.4  制備GM-CSF修飾的NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞 NuTu-19細(xì)胞重復(fù)病毒感染培養(yǎng)3 d后傳代并加入G418加壓篩選，14 d后絕大部分細(xì)胞死亡，瓶內(nèi)形成單克隆細(xì)胞集落，后細(xì)胞集落開始生長成片，25 d后撤去G418，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至貼滿瓶壁。 2.5  免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果 轉(zhuǎn)染的NuTu-19細(xì)胞胞膜表面有深棕褐色著色，與未轉(zhuǎn)染的NuTu-19細(xì)胞形成鮮明對比，胞質(zhì)內(nèi)較少見明顯褐色顆粒沉淀(圖4、圖5)。 2.6&

24、#160; NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞分泌表達(dá)GM-CSF蛋白檢測結(jié)果 pLGM-CSFSN轉(zhuǎn)染的NuTu-19細(xì)胞的培養(yǎng)上清ELISA檢測GM-CSF，其A值為1.267±0.07；空質(zhì)粒pLXSN轉(zhuǎn)染的NuTu-19細(xì)胞培養(yǎng)上清其A值為0.32±0.02，實(shí)驗(yàn)組/陰性對照組>2.1，表明pLGM-CSFSN轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠表達(dá)GM-CSF，質(zhì)量濃度約為150 pg/mL。 3  討 論 隨著腫瘤免疫學(xué)的不斷深入發(fā)展，腫瘤免疫治療也隨之發(fā)展并逐步成為人們研究治療腫瘤的新熱點(diǎn)。目前腫瘤免疫治療主要包括多肽類疫苗、基因疫苗、樹突狀細(xì)胞疫苗和腫瘤全細(xì)胞疫苗，

25、其中腫瘤全細(xì)胞疫苗可以將所有可能與腫瘤相關(guān)的抗原加工提呈給抗原提呈細(xì)胞(APC)，從而激起體內(nèi)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)?？紤]到腫瘤細(xì)胞的弱抗原性，許多研究者結(jié)合免疫佐劑、細(xì)胞因子或者與樹突狀細(xì)胞融合制備疫苗，使機(jī)體能將更多的腫瘤抗原提呈給T淋巴細(xì)胞，激起體內(nèi)更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。 GM-CSF不僅促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞系的存活、生長、分化,而且還能促進(jìn)成熟的巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的存活、生長、分化及功能活化1。它是由T細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞在受到免疫刺激時分泌的。盡管分泌具有局限性，但能通過旁分泌的作用來招募中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞來增強(qiáng)宿主的防御能力2。GM-CSF還可以

26、通過活化Jak/STAT信號途徑抑制早期多核嗜中性淋巴細(xì)胞的自發(fā)性凋亡3。目前世界公認(rèn)用GM-CSF生物制劑用于治療化療后白細(xì)胞減少是有效的，并廣泛應(yīng)用于臨床。在腫瘤免疫治療的研究中，Dinc等4用二甲肼在大鼠體內(nèi)造結(jié)腸癌腫瘤模型中研究發(fā)現(xiàn)GM-CSF能降低腫瘤的發(fā)生率。Dranoff等5比較TNF、GM-CSF等10種細(xì)胞因子基因的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的GM-CSF最有潛力，它能引起持久的特異性抗腫瘤效應(yīng)。此后GM-CSF被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究中。 GM-CSF做為抗腫瘤免疫治療佐劑的研究已相當(dāng)成熟，并部分應(yīng)用于臨床研究中。日本于1998年進(jìn)行轉(zhuǎn)GM-CSF基因的自體腎癌細(xì)胞瘤

27、苗對晚期患者行在體免疫治療的第一期臨床研究，受試對象為第IV期腎癌腫瘤患者伴肺轉(zhuǎn)移，結(jié)果表明基因修飾的瘤苗治療在體實(shí)驗(yàn)無明顯的毒副作用，不僅有抑制腫瘤惡化進(jìn)展的趨勢，且在腫瘤組織病檢中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中有大量的淋巴細(xì)胞浸潤，以CD8+細(xì)胞為主6。此外在前列腺癌、黑色素瘤中的治療研究中也得到相同的效應(yīng)。無論動物實(shí)驗(yàn)或者臨床實(shí)驗(yàn)均未見到GM-CSF修飾的瘤苗在治療研究中會引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，其大部分不良反應(yīng)只包括頭疼、發(fā)熱、局部注射部位紅腫發(fā)熱等7。近期研究表明GM-CSF在正常卵巢組織中亦有少量表達(dá)，大部分由黃體組織合成分泌的，盡管GM-CSF不是卵巢生長所必需的，但它不僅對從卵泡期到黃體期轉(zhuǎn)變過程

28、起重要作用，而且還可以通過活化黃體期卵巢組織中的巨噬細(xì)胞來調(diào)節(jié)體內(nèi)類固醇激素的生成8。國內(nèi)外對GM-CSF是否促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞增殖也進(jìn)行了許多研究，目前研究結(jié)果不支持GM-CSF有促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞增殖的作用9。所以，GM-CSF是一種比較理想也比較成熟的免疫佐劑，安全有效且其本身具有一定的抗腫瘤效應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)是利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建含有人GM-CSF基因的重組反轉(zhuǎn)錄載體pLGM-CSFSN，經(jīng)包裝細(xì)胞PA317包裝病毒后感染NuTu-19細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選后獲得感染成功的NuTu-19/GM-CSF細(xì)胞，并從形態(tài)學(xué)方面檢測與未感染的NuTu-19細(xì)胞相比，感染后的NuTu-19/GM-C

29、SF細(xì)胞分泌表達(dá)GM-CSF蛋白量明顯增多，且成功分泌表達(dá)到胞外，其分泌量約為150 pg/mL。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的NuTu-19細(xì)胞胞膜表面有深棕褐色著色，與未轉(zhuǎn)染的NuTu-19細(xì)胞形成鮮明對比。胞質(zhì)內(nèi)較少見明顯褐色顆粒沉淀可能一方面是GM-CSF本身攜有信號肽,是一種分泌性蛋白，合成之后在信號肽引導(dǎo)下穿胞膜分泌到細(xì)胞外上清液中，另一方面由于G418加壓篩選本身對細(xì)胞來說是一種損傷。   總之，本實(shí)驗(yàn)將GM-CSF基因整合修飾卵巢癌細(xì)胞，使其穩(wěn)定表達(dá)GM-CSF蛋白，為下一步動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行免疫治療研究奠定安全、可靠、有效的基礎(chǔ)。 【參考文獻(xiàn)】   1Inaba K

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