P. yoelii 17XL感染小鼠Treg影響Th應(yīng)答特點(diǎn)的實驗研究

1、P. yoelii 17XL感染小鼠Treg影響Th應(yīng)答特點(diǎn)的實驗研究1 引言瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病。據(jù)WHO 報告，全球約40%的人受到瘧疾威脅，每年約3.5-5 億人感染，因瘧疾而死亡的兒童可超過100萬1。瘧疾的流行已成為全球性最嚴(yán)重的三大公共衛(wèi)生問題之一，給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹藝?yán)重的健康危害和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)2。因此，研制安全、價廉和有效的瘧疾疫苗是人類控制乃至根除瘧疾的重要途徑，也是當(dāng)今世界迫切需要解決的重點(diǎn)課題。而瘧原蟲感染宿主機(jī)體應(yīng)答的免疫學(xué)、分子生物學(xué)等綜合基礎(chǔ)研究是其重要前提。關(guān)于紅內(nèi)期瘧原蟲感染的免疫機(jī)制，其他學(xué)者及我們前期的研

2、究結(jié)果均已證實36：CD4+T 細(xì)胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在瘧疾感染早期，DC 產(chǎn)生IL-12 誘導(dǎo)以IFN-分泌增加的Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，并通過TNF- 及NOs 遏制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖；隨之，由Th2 型細(xì)胞輔助B 細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，有效地清除瘧原蟲，防止復(fù)發(fā)和再燃。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是體內(nèi)天然存在的具有獨(dú)特調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群3。Tregs 不同于Th1 和Th2，具有廣泛的免疫抑制性，通過表面膜分子與其他細(xì)胞直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10 和TGF-等方式，抑

3、制體內(nèi)CD4+T 細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的活化和增殖7, 8。實驗研究顯示，瘧原蟲感染中Tregs 的參與可能影響了宿主Th1/Th2 型細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過度9。本研究利用建立的P.y17XL 感染DBA/2 和BALB/c 小鼠模型，對比分析瘧原蟲感染宿主免疫應(yīng)答的變化特點(diǎn)與Treg 數(shù)量變化之間的關(guān)系，以期確立Tregs在調(diào)控保護(hù)性和病理性免疫應(yīng)答中的效應(yīng)機(jī)制，為瘧疾等感染性疾病的有效控制提供新的理論依據(jù)。2 材料與方法2.1 瘧原蟲及實驗動物感染68 周齡、雌性DBA/2 和BALB/c 小鼠（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，許可證編號：SCXK 京2004-0001），經(jīng)腹腔

4、感染1106 P.y17XL（日本愛嬡大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈）寄生的紅細(xì)胞。于感染后不同時間采小鼠尾靜脈血，制備薄血膜，Giemsa 染色，計數(shù)紅細(xì)胞感染率。2.2 脾細(xì)胞培養(yǎng)無菌取出感染0d、1d、3d、5d、8d、10d、12d 和15d 的小鼠脾臟，用FCS-RPMI 1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，350g 離心10min，用0.17 M NH4Cl 裂解紅細(xì)胞，RPMI 1640 洗滌兩次。以含10% FCS-RPMI 1640 調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1107/ml，于24 孔培養(yǎng)板上加入細(xì)胞懸液，500l/孔，以RPMI-1640 為對照，于37C 培養(yǎng)48h。350g 室溫離心10m

5、in，收集上清，-80C 保存，待IFN- 和IL-4 檢測。2.3 IFN- 和IL-4 檢測用雙抗體夾心ELISA 法對小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清的IFN- 和IL-4 的含量分別進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀檢測450nm 處OD 值。應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 LS 軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞因子含量（pg/ml）。2.4 流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞數(shù)量每份樣品用CD4-FITC 單抗（clone GK1.5）、CD25-PE 單抗（clone 3C7）和Foxp3-APC單抗（clone FJK16s）進(jìn)行三色分析，另設(shè)陰性對照管。流式細(xì)胞儀專用染色管預(yù)先加入Fc

6、III/II 封閉抗體，取新鮮制備的1 106 / ml 脾細(xì)胞懸液0. 1 ml，37C 條件下PMA 和伊屋諾霉素刺激2h 后加入Golgi Stop 共同培養(yǎng)4h，3%FCS 洗滌后加入FITC-anti-CD4 andPE-anti-CD25 熒光抗體孵育30min，3%FCS 洗滌后加入固定透膜劑孵育，然后加入APC-anti-Foxp3 熒光抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。同時用FITC rat IgG2b 作為同型對照。利用流式細(xì)胞儀( FACSCalibur，美國B&D 公司)，使用前向散射角（FSC）及側(cè)向散射角（SSC）確定淋巴細(xì)胞群，應(yīng)用FACSCELLQUEST 軟件，每個樣品分析

7、10000 個細(xì)胞，以陰性對照為參考，將對照管所示的非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點(diǎn)陣圖顯示，記錄Tregs的百分率。2.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5 統(tǒng)計學(xué)分析軟件，雙尾t 檢驗分析比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異。3 結(jié)果3.1 P.y17XL 感染小鼠原蟲血癥水平及生存率P.y17XL 感染后第2 d，兩種小鼠外周血涂片均查到瘧原蟲；感染后第3 d，紅細(xì)胞感染率均為2%4%。隨后，BALB/c 小鼠原蟲血癥水平迅速升高，感染后第5 d 紅細(xì)胞感染率50%，感染后第5 d 及次日小鼠全部死亡；DBA/2 小鼠原蟲血癥水平上升緩慢，感染后第9 d紅細(xì)胞感染率峰值為34%，觀察期內(nèi)小

8、鼠全部存活。3.2 P.y17XL 感染小鼠不同時間IFN- 分泌水平P.y17XL 感染的BALB/c 小鼠脾細(xì)胞上清中IFN- 水平僅在感染后第3d 出現(xiàn)一過性有意義的升高（P0.01)；而DBA/2 小鼠IFN- 水平在感染后第1d 開始出現(xiàn)有意義的升高，第3d 達(dá)峰值（P0.01)，是同天感染BALB/c 小鼠的5.4 倍，隨后在感染后第5d 雖有下調(diào)但仍保持有意義的升高，直至感染后第8d 回落至正常水平。3.3 P.y17XL 感染小鼠不同時間IL-4 分泌水平P.y17XL 感染的BALB/c 小鼠脾細(xì)胞上清中IL-4 水平僅在感染后第3d 出現(xiàn)有意義的升高，而DBA/2 小鼠IL

9、-4 水平在感染后第5d 開始出現(xiàn)有意義的升高，第8d 達(dá)峰值（P0.01)，此后雖有回落但仍維持其高水平，感染后第15d 回落至正常水平。3.4 P.y17XL 感染小鼠不同時間脾Tregs 數(shù)量檢測P.y17XL 感染小鼠于感染后第1d Tregs 均出現(xiàn)有意義的升高。隨后DBA/2 小鼠Tregs緩慢上升，感染后第5d 達(dá)峰值約占CD4+T 細(xì)胞的14（P0.01），然后又開始緩慢下降，小鼠全部存活；而BALB/c 小鼠Tregs 數(shù)量迅速上升，感染后第5d 達(dá)峰值約占CD4+T 細(xì)胞的38（P0.01），小鼠全部死亡。4 結(jié)論關(guān)于紅內(nèi)期瘧原蟲感染的免疫機(jī)制，無論鼠瘧模型和人體試驗研究結(jié)

10、果均已證實：CD4+T 細(xì)胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Th1-Th2 連續(xù)活化是確保保護(hù)性免疫效應(yīng)發(fā)揮的關(guān)鍵10, 11。Th1/Th2 之間的平衡及協(xié)調(diào)不但能夠控制急性期的危象，而且最終能夠清除瘧原蟲。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P.y17XL 感染的DBA/2 和BALB/c 小鼠在感染過程中，免疫應(yīng)答存在明顯差異性。原蟲血癥水平作為反映瘧原蟲紅內(nèi)期感染狀況的直接的特征性指標(biāo)顯示，在P.y17XL 感染3d 后，BALB/c 小鼠的原蟲血癥水平迅速持續(xù)上升，至感染后第5d 高達(dá)近50%而全部死亡；同時IFN- 和IL-4 分泌水平僅在感染后第3d 出現(xiàn)一過性有意義的升高，而且峰值

11、較低；與之相比，DBA/2 小鼠的原蟲血癥水平上升較為緩慢，且峰值較低，于感染后第9d 原蟲血癥達(dá)峰值僅為32%；IFN- 分泌水平在感染后第3d 達(dá)峰值，并且直至感染后第8d 一直維持較高水平，而IL-4 分泌水平在感染后第8d 達(dá)峰值，并且直至感染后12d 始終保持較高水平；由此可見，P.y17XL 感染的DBA/2 小鼠能夠在感染過程中建立有效的Th1 和Th2 型細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且保護(hù)性免疫應(yīng)答能有效地從Th1 向Th2 型應(yīng)答過渡，感染小鼠全部存活；相反，BALB/c 小鼠未能建立有效的Th1 應(yīng)答控制紅內(nèi)期瘧原蟲的爆發(fā)性增殖，導(dǎo)致最終死亡的感染結(jié)局。為進(jìn)一步確定Tregs 與Th1

12、/Th2 應(yīng)答建立和轉(zhuǎn)化的相關(guān)性，我們觀察了Tregs 的數(shù)量變化。本實驗結(jié)果顯示，P.y17XL 感染的DBA/2 小鼠IFN-在感染后第3d 出現(xiàn)明顯高水平增高的同時Tregs 數(shù)量僅出現(xiàn)一過性低水平增加，并于感染5d 后恢復(fù)正常水平，而且IL-4 在感染后第8d 也出現(xiàn)高水平升高。反之，BALB/c 小鼠在感染后第1d Tregs 就出現(xiàn)明顯的數(shù)量增加，至感染后第5d 異常升高達(dá)峰值。與此同時，IFN-和IL-4 水平均在感染后第3d 呈一過性低幅度升高后迅速下降，原蟲血癥驟然上升。由此提示BALB/c 小鼠的Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答未能建立與Tregs 數(shù)量過早升高的現(xiàn)象密切相關(guān)。實驗研

13、究發(fā)現(xiàn)，消除P.berghei NK65 感染小鼠體內(nèi)的Tregs 可延緩其瘧原蟲的生長12；體內(nèi)消除P.berghei ANKA 感染小鼠的Tregs，可以建立誘導(dǎo)腦瘧發(fā)生的Th1 型免疫應(yīng)答13；提示Tregs 可能在瘧疾感染過程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。在此，本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，P.y17XL 感染的BALB/c 小鼠Tregs 在Th1 型免疫應(yīng)答建立的重要時期出現(xiàn)提早升高。由此提示，P.y17XL 易感小鼠BALB/c 難以建立有效的Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答與Tregs 過早升高密切相關(guān)，Tregs 在瘧原蟲感染過程中介導(dǎo)免疫抑制作用。綜上所述，P.y17XL 感染早期，BALB/c

14、 小鼠Tregs 數(shù)量的過早升高明顯影響宿主的易感性。Tregs 可能與Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效建立密切相關(guān)，其抑制效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。中國醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)專業(yè)提供醫(yī)學(xué)論文發(fā)表服務(wù)，并提供大量醫(yī)學(xué)檢驗論文，如有業(yè)務(wù)需求請咨詢網(wǎng)站客服人員！參考文獻(xiàn)1 Pierce SK and Miller LH. World Malaria Day 2009: What Malaria Knows about the Immune System ThatImmunologists Still Do Not J? J Immunol, 2009, 182(9): 51715177.2 Njau JD, Goodm

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