酪氨酸酶抑制劑對生育期雌性大鼠的抗生育效應(yīng)研究

1、酪氨酸酶抑制劑對生育期雌性大鼠的抗生育效應(yīng)研究                        作者：鐘興明 鐘依平 齊詮 韋相才【摘要】  目的：動物實驗觀察酪氨酸酶抑制劑對生育期雌性大鼠的抗生育效應(yīng)。方法：將90只檢查陰栓為陽性的小鼠隨機分為3組，每組30只。低劑量組每日灌胃大豆異黃酮40mg.kg-1.d-1；高劑量組每日灌胃大豆異黃酮80mg.kg-1

2、.d-1，正常對照組每日灌胃等量生理鹽水。于D4觀察囊胚和胚胎個數(shù)，D6觀察著床胚胎數(shù)，D20剖腹檢查活胎數(shù)。結(jié)果：D4正常對照組、低劑量組和高劑量組的囊胚發(fā)育率分別為84.8%（106/125），65.63%(84/128)， 62.4%（78/125）。D6正常對照組、低劑量組和高劑量組的平均著床胚胎數(shù)分別為5.25個，1.71個和1.33個。D20剖宮取胎，正常對照組、低劑量組和高劑量組的平均活胎數(shù)分別為4.6個，0.9個和0.7個。3組相比較，正常對照組的囊胚發(fā)育率、平均著床胚胎數(shù)和平均活胎數(shù)顯著高于低劑量組和高劑量組（P0.05）。結(jié)論：大豆異黃酮作為一種酪氨酸酶抑制劑，可抑制生育期

3、的雌性小鼠胚泡的發(fā)育和胚胎著床，但具體劑量和機制需進一步深入研究。 【關(guān)鍵詞】  酪氨酸激酶； 大豆異黃酮； 抗著床酪氨酸激酶（tyrosine protein kinase ,PTKs）是一組酶系，是在正常和異常增殖過程中起重要作用的癌蛋白和原癌蛋白家族中的成員。多種生長因子包括表皮生長因子（EGF）、血小板源生長因子（PDGF）和胰島素樣生長因子（IGF）的受體都有PTKs活性。PTK途徑的激活屬于與細胞的生長、增殖和分化有關(guān)的信號途徑。目前，PTK抑制劑在醫(yī)學上的應(yīng)用主要是抗腫瘤。近來研究還發(fā)現(xiàn)PTKs的活性與非腫瘤細胞的生理活動有關(guān)，許多PTKs抑制劑能影響正常細胞的功能和機

4、能，在這一方面研究較多的是一些發(fā)現(xiàn)較早的天然化合物如染料木黃酮（genistein，GST）、herbimycin  A和lavendustin A。大量的研究已證實，GST在防治癌癥、降低血脂、婦產(chǎn)科的激素替代治療、激素依賴性腫瘤的防治方面有著廣闊的應(yīng)用前景1，但對于抗生育方面的研究較少。本研究通過小鼠動物實驗觀察大豆異黃酮對青年雌性大鼠生育功能的影響。    1  材料與方法    1.1  材料    1.1.1  實驗動物  性成熟期的健康昆明小白

5、鼠，清潔級，雌性100只，68周齡，體重2530g，連續(xù)觀察兩個動情周期均正常；雄鼠15只，34月齡，體重大于30g，雄鼠均采用單籠飼養(yǎng)；喂養(yǎng)顆粒飼料，光照周期12 L:12 d，自由攝食飲水。由南方醫(yī)科大學動物中心提供。    1.1.2  受試物  大豆異黃酮類提取物，由某生物制品公司提供。總的異黃酮含量為22%，其中大豆黃酮9.5%，大豆甙元1.5%，金雀異黃酮10.3%，金雀異黃素(genistein)0.7%,總的游離甙元(有效生物濃度)含量14.4%。動物實驗用劑量參考徐叔云“藥理實驗方法”計算2。   

6、; 1.1.3  試劑及儀器  二甲亞楓(dimethylsulfoxide, DMSO)購自生工生物工程(上海)有限公司；實驗用M2囊胚培養(yǎng)液由中山大學轉(zhuǎn)基因動物實驗室提供(為Sigma產(chǎn)品)。    1.2  試驗方法及內(nèi)容    1.2.1  動物適應(yīng)性飼養(yǎng)  實驗動物在中山大學北校區(qū)動物中心二級實驗動物房（溫度2024，濕度40%70%，12 h明暗交替）單籠飼養(yǎng)適應(yīng)1 w。    1.2.2  實驗步驟  雌雄小鼠21合籠，次

7、晨檢查陰栓，陽性者定為妊娠第1天，記為D1。其中，100只雌性小鼠中有92只次晨檢查陰栓為陽性。隨機將其中90只分為3組，每組30只。每日上午連續(xù)灌胃相應(yīng)劑量藥物。低劑量組每日灌胃大豆異黃酮40mg.kg-1.d-1；高劑量組每日灌胃大豆異黃酮80mg.kg-1.d-1，按灌胃量為1 ml.150 g-1.d-1配制。正常對照組每日灌胃等量生理鹽水。于D4下午用頸椎脫臼法每組處死1/3小鼠，取出輸卵管、子宮。自輸卵管傘端及子宮與輸卵管連接處用預平衡過夜的M2培養(yǎng)液灌注沖出胚胎，用顯微操作系統(tǒng)中的倒置顯微鏡(德國Leica公司)觀察囊胚形態(tài)學、統(tǒng)計胚胎個數(shù)，計算囊胚發(fā)育率，留取子宮待檢。每組的另

8、1/3小鼠于D6用頸椎脫臼法處死，處死前5min從鼠尾注射1%的芝加哥藍B染液0.1ml，肉眼觀察著床胚胎數(shù)(子宮壁上每出現(xiàn)一條藍色深帶為一處胚胎著床點)，統(tǒng)計每組著床胚胎總數(shù)及妊娠率3。將每組剩余1/3小鼠繼續(xù)按相同方法喂養(yǎng)，于第20d處死并稱重，剖腹取出子宮和胎鼠，檢查死胎和活胎數(shù)。    1.3  數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計    所有數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件包建庫并計算各組各指標的平均值，進行均數(shù)和方差分析。百事通    2  結(jié)果    2.1 

9、 大豆異黃酮對胚泡在體內(nèi)發(fā)育的影響    光鏡下，3組共獲取胚胎378個，其中正常對照組為125個，低劑量組為128個，高劑量組為125個。3組相比較，獲取胚胎總數(shù)無顯著差異（P0.05）。其中，正常對照組見106個胚胎發(fā)育成囊胚，囊胚發(fā)育率為84.8%（106/125）；低劑量組見84個胚胎發(fā)育成囊胚,囊胚發(fā)育率為65.63%(84/128)；高劑量組見73個胚胎發(fā)育成囊胚，囊胚發(fā)育率為62.4%（78/125）。3組相比較，正常對照組的囊胚發(fā)育率較低劑量組和高劑量組顯著增高（P0.05），而低劑量組的囊胚發(fā)育率和高劑量組相比較無顯著差異（P0.05）。

10、0;   2.2  大豆異黃酮對胚胎著床的影響    3組共獲得孕鼠18只。其中正常對照組8只，妊娠率為80%；低劑量組為7只，妊娠率為60%；高劑量組為3只，妊娠率為30%。3組相比較，高劑量組的妊娠率顯著低于正常對照組和低劑量組（P0.05）。正常對照組和低劑量組的妊娠率相比較無顯著差異（P0.05）。3組共獲得的著床胚胎總數(shù)為58個，其中正常對照組為42個，平均著床胚胎數(shù)為5.25個；低劑量組著床胚胎總數(shù)為12個，平均著床胚胎數(shù)為1.71個；高劑量組著床胚胎總數(shù)為4個，平均著床胚胎數(shù)為1.33個。3組相比較，正常對照組的著床胚胎

11、總數(shù)和平均著床胚胎數(shù)顯著高于低劑量組和高劑量組（P0.05）。    2.3  大豆異黃酮對胎鼠的影響    剖宮取胎后共獲得活胎62個，均未見死胎和畸胎。其中正常對照組為46個，平均活胎數(shù)為4.6個，低劑量組為9只，平均活胎數(shù)為0.9個，高劑量組為7只，平均活胎數(shù)為0.7只。3組相比較，正常對照組的活胎總數(shù)和平均活胎數(shù)顯著高于低劑量組和高劑量組（P0.01）。    3  討論    大豆異黃酮是一種黃酮類的PTKS抑制劑，其中包含大豆黃酮、大豆甙元、金

12、雀異黃酮和金雀異黃素（genistein）等。國內(nèi)研究表明，大豆異黃酮提取物對酪氨酸酶活性有比較強的抑制作用，并且隨著大豆異黃酮提取物濃度的提高，其對酪氨酸酶活性的抑制率也提高4。Genistein是ATP與PTK結(jié)合的競爭性抑制劑，能有效地抑制EGF酪氨酸激酶?，F(xiàn)有學者發(fā)現(xiàn)，在黃體細胞的體外培養(yǎng)中，應(yīng)用PTK抑制劑不僅可明顯拮抗EGF升高孕酮的作用，而且在小鼠的胚泡體外發(fā)育和胚胎移植的過程中可明顯抑制胚胎著床5。另外，從結(jié)構(gòu)上講，genistein屬于一種植物雌激素6，既能代替雌激素和ER結(jié)合，發(fā)揮雌激素樣作用，又能干擾雌激素和ER結(jié)合，表現(xiàn)抗雌激素作用，具有雙向性。Dechaud H研究發(fā)

13、現(xiàn)，genistein可以與3H標記的雌二醇競爭性地結(jié)合性激素型球蛋白，從而干擾雌激素與其受體結(jié)合，破壞體內(nèi)的激素平衡。通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，動物攝入過量的植物雌激素，能干擾促性腺激素釋放的反饋系統(tǒng)，導致生育問題7。近年來對靈長類胚泡著床的研究表明，著床期子宮內(nèi)膜也需要基礎(chǔ)水平的雌激素，而且孕激素受體的表達有賴于雌激素的誘導，因此利用小劑量genistein的抗雌激素作為抗著床的可能性是存在的。趙更力8的研究表明，應(yīng)用大豆異黃酮后,內(nèi)膜表現(xiàn)出不同程度的增生、子宮重量明顯增加，而且子宮重量系數(shù)和內(nèi)膜增生程度與大豆異黃酮的劑量有關(guān)，表明大豆異黃酮具有雌激素樣作用并且作用強度與劑量有關(guān)，大劑量大豆異黃酮

14、引起子宮內(nèi)膜的增生反應(yīng)明顯。本實驗結(jié)果顯示，在喂養(yǎng)不同劑量的大豆異黃酮后，D4獲取的胚胎總數(shù)和囊胚的發(fā)育率較對照組顯著降低（P0.05）；D6獲得的胚胎著床數(shù)和平均著床胚胎數(shù)較對照組顯著降低（P0.05）；D20獲得的活胎總數(shù)和平均活胎數(shù)也較對照組顯著降低（P0.01）。說明大豆異黃酮對生育期雌性小鼠存在著明顯的抗生育效應(yīng)。遲曉星等9認為大豆異黃酮對青年雌性大鼠體質(zhì)量的影響不顯著，但高劑量組大鼠的卵巢發(fā)生了病理變化，主要表現(xiàn)為卵泡增多，體積增大，卵泡內(nèi)顆粒層細胞增多，厚度增加，卵泡液豐富。推測在300 mg/kg?bw的劑量下，大豆異黃酮可能會對青年雌性大鼠卵巢產(chǎn)生影響。Genistein與E

15、2一樣，在低濃度時促進黃體酮的合成，高濃度時則抑制其合成10。Genistein對于年輕動物、雌激素化的動物及年輕婦女等高雌激素水平者，表現(xiàn)為抗雌激素活性，而在E2較低的自然絕經(jīng)和手術(shù)絕經(jīng)的婦女則顯示雌激素樣作用11。有研究發(fā)現(xiàn)，青年婦女每天服用異黃酮45mg，月經(jīng)周期推遲1.5天，卵泡相延長2.5天，黃體相縮短1天。因而，從理論上推測genistein作為PTKS抑制劑一方面可干擾著床時細胞因子的信號轉(zhuǎn)導，破壞蛻膜組織的細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡；另一方面對體內(nèi)高雌激素水平的生育期雌性小鼠還具有抗雌激素作用，故其具有抗著床作用。本研究結(jié)果還顯示，大豆異黃酮雖可抑制胚泡發(fā)育和胚胎著床，但對于著床后的胚胎

16、發(fā)育卻無明顯影響，剖宮取胎未發(fā)現(xiàn)死胎或畸胎。綜上所述，大豆異黃酮作為黃酮類的PTKS抑制劑，對生育期雌性小鼠具有一定的抗生育作用。但具體的抗著床劑量及機制，還需進行更深入的研究，為新型避孕藥物的研究及開發(fā)提供理論及實驗支持?！緟⒖嘉墨I】  1 Arena S , Rappa C, Del Frate E，et al . Anatural alternative to menopausal hormone replacement therapy . Phytoestrogens. Minerva Ginecol , 2002 , 54(2):5358.2 徐叔云,卞如濂，陳修.藥理實驗

17、方法學.第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991，17880.3 范立青，盧光?L，盧惠霖.表皮生長因子受體特異的酪氨酸酶抑制劑對小鼠胚泡體外發(fā)育和胚胎著床的影響.生殖與避孕，1997，17（6）：365366.4 魏振承，孫玲，張雁，等.大豆異黃酮對酪氨酸酶抑制作用的研究.廣州食品工業(yè)科技，2004，20（3）：1011.5 Lachgar S,Moukadiri H,Jonca F , etal . Vascular endothelial growth factor is an autocrine growth factor for hair dermal papilla cells .

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