乙型肝炎病毒載量與其血清學(xué)標(biāo)志模式關(guān)系的研究

1、乙型肝炎病毒載量與其血清學(xué)標(biāo)志模式關(guān)系的研究    nbsp;nbsp;nbsp;【摘要】nbsp;目的nbsp;對(duì)乙型肝炎病毒（HBV）DNA載量與HBV血清標(biāo)志的關(guān)系進(jìn)行研究，探討乙型肝炎病毒載量與機(jī)體免疫反應(yīng)的關(guān)系，為抗病毒治療提供科學(xué)依據(jù)。方法nbsp;用熒光定量PCR法和ELISA檢測HBVnbsp;DNA     王洪 李勇年 陳玉湘 李梅玲     【摘要】 目的 對(duì)乙型肝炎病毒（HBV）DNA載量與HBV血清標(biāo)志的關(guān)系進(jìn)行研究，探討乙型肝炎病毒載量與機(jī)體免疫反應(yīng)的關(guān)系，

2、為抗病毒治療提供科學(xué)依據(jù)。方法 用熒光定量PCR法和ELISA檢測HBV DNA和抗原抗體，統(tǒng)計(jì)分析不同HBV DNA量的抗原抗體表達(dá)模式。結(jié)果 所有病例中，90.9%為HBsAg陽性，85.3%抗-HBc-IgG陽性。HBsAg和BeAg雙陽性模式中，HBV載量10 5 /ml10 7 /ml者，占29.9%，HBV載量>10 7 /ml者，占54.9%。在HBsAg陽性，抗-HBe陽性模式中，HBV載量10 5 /ml10 7 /ml者和HBV載量>10 7 /ml者各占29.4%和31%。HBeAg陽性模式HBV載量顯著高于HBeAg陰性模式，抗-HBe陰性模式HBV載量顯著

3、高于抗-HBe陽性模式。結(jié)論 HBeAg陽性模式HBV載量顯著高于HBeAg陰性模式，抗-HBe陰性模式HBV載量顯著高于抗-HBe陽性模式。但在少部分患者剛好相反，因此，對(duì)一個(gè)具體的患者，不能只根據(jù)抗原抗體模式來判斷病毒復(fù)制程度及其傳染性的強(qiáng)弱。       關(guān)鍵詞 乙型肝炎病毒 聚合酶鏈反應(yīng) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)        Observation on relationship between the quantities of virus  and the models of serolo

4、gic markers in patients infected with HBV         Wang Hong，Li Yongnian，Chen Yuxiang，et al.       Department of Infection Diseases，323Hospital of PLA，XiAn710054.         【Abstract】 Objective To explore the relationship b

5、etween the quantities of HBV and the models of serologic markers.Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was used to measure the HBV DNA and ELISAwas used to detct the antigen/antibody of HBV.Results The HBsAg positive rate was90.9%，anti-HBc-IgG was85.3%.The patients whose HBV copies were mor

6、e than10 7 /ml accounted for54.9%，whose HBV DNA copies was10 5 /ml10 7 /ml accounted for29.9%among the HBsAg and HBeAg positive patients.The patients whose HBV copies were more than10 7 /ml and10 5 /ml10 7 /ml accounted for31%and29.4%among the anti-HBe positive patients，respectively.The HBV copies o

7、f HBeAg-positive patients were significantly more than anti-HBe-positive patients.The HBV copies of anti-HBe-negative patients were significantly more than anti-HBe-positive patients.Conclusions The HBV copies of HBeAg-positive patients were significantly more than HBeAg-negative patients，The HBV co

8、pies of anti-HBe-negative patients were significantly more than anti-HBe-positive patients.However，some HBeAg-positive patients HBV copies are very low，and some HBeAg-negative patients HBV copies are very high.HBVDNA could be detected in some HBeAg-negative patients.It is difficult to judge accurate

9、ly the quantities of HBV and infectivity according to the serologic markers for a specific patient.         Key words hepatitis B virus polymerase chain reaction fluorescent-probe real-time enzyme-link immunosorbent assay        乙型肝炎病毒（HBV）

10、載量與抗原抗體的關(guān)系是臨床、流行病學(xué)和基礎(chǔ)研究中共同關(guān)心的問題。近年建立的熒光定量PCR方法，為定量觀察病人提供了一個(gè)敏感的指標(biāo)，熒光定量PCR具有敏感性高，重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，定量范圍寬等優(yōu)點(diǎn) 13  。我們用這個(gè)方法檢查我科537例門診患者HBV載量，以探討感染HBV后患者的血清病毒水平與抗原抗體的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。       1 資料與方法       1.1 病例 均為我院2002年11月2003年6月門診患者，年齡和性別不限，近半年內(nèi)無使用干擾素、拉米夫定史。所有入組病例肝功化驗(yàn)ALT正

11、?；虻陀谡Ｉ舷薜?倍，總 膽紅素正常。采靜脈血，當(dāng)日分離血清，檢測，或4保存，次日檢測。一般進(jìn)行1次HBV-DNA定量和抗原抗體檢查，對(duì)于HBeAg陽性而病毒拷貝數(shù)低，抗-HBc陰性而病毒拷貝數(shù)高，HBeAg和抗-HBe、HBsAg和抗-HBs同時(shí)陽性者均進(jìn)行復(fù)查。       1.2 HBV抗原抗體測定 采用ELISA法，試劑由上?？迫A生物工程股份公司提供，由專人按產(chǎn)品說明書操作，目測定性檢查。       1.3 HBV定量檢測方法       1.3.1 儀器、試劑及

12、試劑盒的使用方法 測定儀器為Roche公司Lightcycler熒光定量基因分析儀。試劑由深圳匹基生物公司提供（SDA審批），采用常規(guī)的堿裂解法，從血清中提取HBV-DNA，加入Roche毛細(xì)玻璃管中，放入Light cycler自動(dòng)熒光檢測儀，按下列條件擴(kuò)增:373min925s6030s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)計(jì)算出定量結(jié)果。       1.3.2 定量方法 HBV-DNA定量PCR采用實(shí)時(shí)FQ-PCR，以起始模板拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值為縱坐標(biāo)，用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)r>0.98，計(jì)算標(biāo)本中起始DN

13、A模板量。以拷貝數(shù)表示DNA含量，檢測靈敏度為10 3 拷貝/ml。       1.4 統(tǒng)計(jì)分析 以HBV-DNA含量為分組依據(jù)，組間HBV-DNA含量相差10 2 拷貝/ml?？乖贵w排列順序:a HBsAg（+），b抗-HBs（+），c HBeAg（+），d抗-HBe（+），e抗-HBc-IgG（+），f抗-HBc-IgM（+）;以陽性項(xiàng)目的序號(hào)代表陽性項(xiàng)，同一患者出現(xiàn)的抗原抗體組合稱為抗原抗體模式，按抗原抗體模式數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析。       2 結(jié)果       2.1

14、 一般資料 537例門診患者，其中男420例、女117例，男女之比3.6:1，年齡為475歲，1660歲者占85.5%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下。       抗原抗體模式:在本研究的病例中，HBsAg陽性488例，占總數(shù)的90.9%，抗-HBc-IgG陽性458例，占總數(shù)的85.3%。共有10種抗原抗體模式。其中a+c+e+f和a+c+e模式（大三陽）313例，占總數(shù)的58.3%。a+d+e模式（小三陽）100例，占總數(shù)的18.6%。而b+d和b+e模式分別有22例和16例。       HBV載量:在所有患者中，HBsAg

15、和HBeAg雙陽性模式中（a+c+e+f、a+c+e和a+c+d），HBV載量<10 3 拷貝/ml者21例，占6.5%，HBV載量10 3 /ml10 5 /ml者8例，占8.6%，HBV載量105/ml10 7 /ml者97例，占29.9%，HBV載量>10 7 /ml者178例，占54.9%。HBsAg陽性，抗-HBe陽性模式（a+d+e和a+d），HBV載量<103拷貝/ml者6例，占21.8%，HBV載量10 3 /ml10 5 /ml者21例，占17.6%，HBV載量10 5 /ml10 7 /ml者35例，占29.4%，HBV載量>10 7 /ml者37例

16、，占31%。雙抗體模式中，b+d模式22例，其中HBV載量<10 3 拷貝/ml者9例，占40.9%，HBV載量10 3 /ml10 5 /ml者10例，占45.5%。b+e模式16例，其中HBV載量<10 3 拷貝/ml者5例，占31.2%，HBV載量10 3 /ml10 5 /ml者11例，占68.8%。在所有患者中，HBsAg和HBeAg雙陽性模式HBV DNA拷貝數(shù)顯著高于HBeAg陰性模式（P<0.01）。       3 討論   血清HBV DNA載量反映了HBV復(fù)制水平的高低，抗原抗體模式是機(jī)體與病毒之間相互作

17、用的結(jié)果，抗原成分反映病毒復(fù)制水平和活躍程度，抗體則反映了機(jī)體免疫反應(yīng)，本文對(duì)抗原抗體模式與血清HBV DNA載量關(guān)系進(jìn)行研究。在本研究中，共有10種抗原抗體表現(xiàn)模式，其中HBsAg陽性有7種模式，病例488例。占總數(shù)的90.9%?？?HBc-IgG陽性458例，占總數(shù)的85.3%。HBsAg和抗-HBc-IgG在大部分HBV感染患者都為陽性。HBeAg陽性（a+c+e+f、a+c+e和a+c+d）模式達(dá)324例，占總數(shù)的60.3%，而且隨著HBV DNA載量的增加所占比例明顯升高。本研究所用方法可靠，樣本量較大，具有一定的代表性。HBsAg和HBeAg是HBV的衣殼蛋白，是HBV的結(jié)構(gòu)蛋 白

18、，在HBV生活周期中具有重要的作用。有大量的研究都證實(shí)，在HBV感染患者外周血中，存在過量的HBsAg，HBsAg曾作為HBV感染的標(biāo)志。從本研究可以看出，HBsAg對(duì)大部分的HBV感染患者仍是一個(gè)有效的診斷指標(biāo)，特別是HBV高病毒載量時(shí)。而在HBV復(fù)制低下時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)漏診。在HBV低病毒載量時(shí)，會(huì)出現(xiàn)部分HBsAg陰性的HBV感染者。       在本研究中，抗-HBc-IgG在所有抗體中出現(xiàn)的比例最高，HBV感染者最常出現(xiàn)的都是抗-HBc，幾乎所有HBV感染患者都出現(xiàn)抗-HBc-IgG，并且其出現(xiàn)與否同病毒的復(fù)制水平并無關(guān)系，說明抗-HBc-IgG

19、不是一個(gè)保護(hù)性的抗體，它只是代表HBV感染刺激機(jī)體發(fā)生了免疫反應(yīng)，但不能控制和清除病毒。B細(xì)胞產(chǎn)生抗體一般需要CD4T細(xì)胞的輔助，有研究發(fā)現(xiàn)抗-HBs和抗-HBe就必須T細(xì)胞的協(xié)助，而無胸腺裸鼠仍然可以產(chǎn)生抗-HBc 4  ，說明抗-HBc的產(chǎn)生不需要T細(xì)胞的輔助。因?yàn)镠BcAg的亞單位成團(tuán)族狀向外形成像鞋釘樣的突起（spike） 5  ，這種突起有利于結(jié)合并交連B細(xì)胞膜受體，從而活化B細(xì)胞，產(chǎn)生抗體。HBeAg是由HBV基因組3.5Kb的mRNA表達(dá)產(chǎn)物，高水平HBeAg是病毒復(fù)制的標(biāo)志，所以通常HBeAg陽性者病毒復(fù)制活躍，傳染性強(qiáng)，HBeAg陰性者病毒復(fù)制水平低。在a

20、+c+e+f組，HBV拷貝數(shù)10 5 /ml10 7 /ml和>10 7 /ml組，分別達(dá)到25.2%和60.8%，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。但HBV拷貝數(shù)<10 3 組仍有6.5%，可能與機(jī)體強(qiáng)大的免疫作用對(duì)病毒復(fù)制的抑制有關(guān)?？?HBe陽性模式即HBeAg陰轉(zhuǎn)并已經(jīng)出現(xiàn)HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，在不同的HBV DNA載量患者中，比例并沒有大的差異，但低病毒載量所占比例明顯升高。在該模式中，HBV DNA載量高的患者仍有一定比例，抗-HBe陽性而HBV拷貝數(shù)高，可能與HBV基因變異有關(guān)。當(dāng)前C基因發(fā)生終止密碼子變異時(shí)（nt1896由G變?yōu)锳），或當(dāng)C啟動(dòng)子（nt1744180

21、4）變異時(shí)，HBeAg表達(dá)終止或減少70%，此時(shí)病毒仍有復(fù)制 6，7  。并且有研究還認(rèn)為前C基因發(fā)生變異時(shí)，不僅病毒復(fù)制仍在繼續(xù)，而且還可能加重肝損傷（本研究未對(duì)感染者進(jìn)行臨床分析，對(duì)此不做進(jìn)一步的討論）。因此。如果排除前C基因變異這個(gè)因素的影響，高病毒載量的抗-HBe陽性患者會(huì)明顯減少，低復(fù)制患者所占比例升高。       抗-HBs陽性者總共38例，而且HBV拷貝數(shù)<105/ml，提示在部分HBV低復(fù)制條件下，可能出現(xiàn)抗-HBs陽性的HBV感染者。HBsAg的消失和抗-HBs的出現(xiàn)一般表示HBV感染的恢復(fù)，HBsAg陰性的HBV感染

22、是近年頗受關(guān)注的問題，在HBV抗病毒治療過程中，部分患者HBsAg從血清中消失后，HBV DNA仍可持續(xù)存在于患者的血液、肝臟中?？?HBs是中和性抗體，可以防止游離病毒感染正常肝細(xì)胞?？?HBs陽性的HBV感染可能系曾經(jīng)接種HBV疫苗并產(chǎn)生抗-HBs，但感染了“a”抗原決定簇變異的HBV?！癮”抗原決定簇是HBV中和抗體作用的靶位，如發(fā)生變異，一方面產(chǎn)生的抗原不能被常規(guī)的免疫試劑檢測到，另一方面變異病毒株可逃避抗體的中和作用。       本研究證明，HBsAg和HBeAg雙陽性模式HBV DNA拷貝數(shù)顯著高于HBeAg陰性模式，高病毒復(fù)制多表現(xiàn)出HB

23、eAg陽性，而低病毒復(fù)制多表現(xiàn)為HBeAg陰性、抗-HBe陽性。但是，在HBeAg陽性模式中，部分患者HBV DNA拷貝數(shù)很低，在HBeAg陰性模式中，部分患者HBV DNA拷貝數(shù)高。因此，對(duì)一個(gè)具體的患者，不能只根據(jù)每個(gè)抗原抗體模式來推測病毒復(fù)制程度及其傳染性的強(qiáng)弱。定量PCR方法檢測的是病毒核酸水平，抗原抗體模式是病毒蛋白水平，臨床判斷分析時(shí)，應(yīng)多方面綜合考慮 8  。       參考文獻(xiàn)       1 Pas SD，F(xiàn)ries E，De Man RA，et al.Development of a

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