煙酰胺高產(chǎn)菌種篩選及煙酰胺檢測(cè)、生產(chǎn)工藝優(yōu)化(正稿)

1、高酶活煙酰胺生產(chǎn)菌株的篩選及腈水合酶催化反應(yīng)條件優(yōu)化摘要煙酰胺作為B族維生素的重要成員，參與了機(jī)體內(nèi)兩種重要輔酶的形成。煙酰胺作為重要的營(yíng)養(yǎng)性添加劑被廣泛應(yīng)用于應(yīng)用于飼料生產(chǎn)行業(yè)，其在醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)的應(yīng)用前景也非常廣闊。在工業(yè)生產(chǎn)方面，人們主要利用化學(xué)法和微生物法進(jìn)行煙酰胺生產(chǎn)。煙酰胺的微生物生產(chǎn)法有著化學(xué)法無(wú)法比擬的優(yōu)越性，此方法對(duì)環(huán)境幾乎不造成污染，且生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)便。在本實(shí)驗(yàn)中，主要以下四個(gè)方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究并取得了一定的成果：(1) 以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種HD1220為出發(fā)菌株，分別使用ARTP誘變、微波誘變、EMS誘變?nèi)N單因子誘變以及在各因子最佳誘變條件下的復(fù)合誘變，確定了復(fù)

2、合誘變的最佳條件為：ARTP誘變時(shí)間240 s；微波誘變強(qiáng)度60 %，微波照射時(shí)間90 s，；EMS濃度0.8 %。誘變完成后，篩選出一株能夠穩(wěn)定遺傳且酶活高達(dá)1764U的高腈水合酶活性菌株，與出發(fā)菌株相比，誘變后菌株酶活提高了33.13 %，并將該菌株暫時(shí)命名為NHD-1。 (2)利用HPLC對(duì)煙酰胺進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)HPLC檢測(cè)的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相流量、流動(dòng)相比例三個(gè)條件進(jìn)行的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終確定HPLC檢測(cè)煙酰胺的各個(gè)最優(yōu)條件為：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流動(dòng)相的流量為0.4 mL/min，流動(dòng)相中甲醇：水=1：3。在以上條件下，煙酰胺出峰時(shí)間為5.306 min，與條件優(yōu)化前相比

3、，煙酰胺出峰時(shí)間明顯縮短。(3) 對(duì)腈水合酶參與煙酰胺生產(chǎn)過(guò)程中酶催化反應(yīng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，我們得出各因素的最佳條件為：菌體濃度1.8 %，菌齡48 h，底物濃度100 g/L，溫度29.5 ，PH 7.4，反應(yīng)時(shí)間30 min，在實(shí)際發(fā)酵后期應(yīng)該對(duì)產(chǎn)物煙酰胺進(jìn)行及時(shí)分離。通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)我們分析出底物濃度、溫度和PH這三個(gè)因素對(duì)腈水合酶的酶活有及其顯著的影響；通過(guò)對(duì)這三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，我們得出了這三個(gè)因素的最佳條件組合為底物濃度98.88 g/L，反應(yīng)溫度29.59 ，PH值7.46。在此條件下酶活響應(yīng)值為1784 U。對(duì)SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果進(jìn)行三

4、次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到腈水合酶的實(shí)際酶活為1775 U，與多元回歸分析所得理論值吻合，說(shuō)明利用響應(yīng)面法能夠很好的優(yōu)化酶催化反應(yīng)條件。ABSTRACTNicotinamide is a kind of Vitamin B and its very important. In the body, Its one part of the formation of two kinds of coenzyme. Nicotinamide is mainly used in feed industry as nutrition additives, it also has a very broad applic

5、ation prospect in medical industry, food industry and cosmetics industry. In the industrial production of nicotinamide ,we mainly use chemical method and biological method. The biological method has a big superiority that chemical method hasnt it does little harm to the environment and has a lower p

6、roduction cost, and its very simple in process.Under the conditions of laboratory, we mainly carried out our research in several aspects and achieved some results as follows:(1) Started from the strain Norcardia sp.HD9611 we had in the laboratory, we used the method of ARTP mutagenesis, microwave mu

7、tagenesis and EMS mutagenesis to make mutagenesis of the strain. The three methods were all used alone. Then we made the composite mutagenesis under best conditions of the three method of mutagenesis. The best conditions of composite mutagenesis were: the time of ARTP mutagenesis was 240 s; the time

8、 and intensity of microwave were 90 s and 60 %; the concentration of EMS mutagenesis was 0.8 %. By the mutagenesis we screened one stain whose nitrile hydratase had a very high enzyme activity of 1764 U and the stain had stable heredity. Compared to the stain Norcardia sp.HD9611, the enzyme activity

9、 increased by 33.13 %, and we named the stain as NHD-1.(2)In the detection of Nicotinamide, we used the HPLC method. By optimizing the wavelength of UV detection, the flow rate of mobile phase and the proportion of mobile phase in the HPLC assay, we got the best conditions of HPLC method : the wavel

10、ength of UV detection was 220 nm; the flow rate of mobile phase was methanol: water=1:3; the proportion of mobile phase was 0.4 mL/min. under these conditions, the peak time of niacinamide was 5.306 min. Compared to the method before optimization we used, the peak time significantly shortened. (3) B

11、y optimizing the conditions of catalytic reaction of the nitrile hydratase, we got the best conditions: the concentration of bacteria producing niacinamide was 1.8 %; the fungus age was 48 h; the concentration of substrate was 100 g/L; the temperature was 29.5 ; the PH was 7.4; the reaction time is

12、30 min, and we should separate nicotinamide late in the actual fermentation. By Plackett-Burman experiment we confirmed that conditions of concentration of substrate, temperature, PH had significant influences on the enzyme activity of nitrile hydratase. By response surface test we optimized these t

13、hree factors: the concentration of substrate was 98.88 g/L; the temperature was 29.59 ; the PH was 7.46. Under these conditions, we analyzed the enzyme activity is 1784 U. Through verification test, we confirmed the enzyme activity of nitrile hydratase was 1775 U. It was very close to the theoretica

14、l value. It showed that the response surface test was a very effective method in optimization of enzyme catalysis.Key word: mutagenes nitrile hydratase enzyme activity HPLC optimization 1前言1.1煙酰胺的概述 1.1.1煙酰胺簡(jiǎn)介煙酰胺（Nicotinamide）化學(xué)名稱為3吡啶甲酰胺，又維生素B3英文簡(jiǎn)稱VB3、NSA1。煙酰胺最早從動(dòng)物肝臟中提取，市場(chǎng)上銷售產(chǎn)品多為化學(xué)合成品2。煙酰胺的分子式如圖1-1：

15、圖1-1 NSA分子式 Fig.1-1 The structure of NSA1.1.2煙酰胺化學(xué)性質(zhì) 煙酰胺為白色針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。熔點(diǎn)為128 131 ，沸點(diǎn)為150 160 。煙酰胺極易溶于水，在一般極性有機(jī)溶劑溶解，在苯和乙醚中無(wú)溶解性3。煙酰胺在空氣中對(duì)光、熱等條件穩(wěn)定，干燥狀態(tài)50 以下極其穩(wěn)定。1.1.3煙酸簡(jiǎn)介煙酸又稱尼克酸，分子式為C6H5NO2，其整體性質(zhì)與煙酰胺極其相似，但由于羧基的存在導(dǎo)致在某些方面不用與含有酰胺基的煙酰胺。兩者通稱維生素PP（二者混合物），在實(shí)際應(yīng)用中，兩者可相互等量替代4。在加熱條件下有無(wú)機(jī)酸和堿存在條件下，煙酰胺發(fā)生水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為煙酸。煙酸分

16、子式如圖2圖1-2 煙酸分子式Fig.1-1 The structure of niacin1.1.4煙酰胺用途煙酰胺參與生物體內(nèi)糖原分解、脂類代謝及各種物質(zhì)的氧化作用5。煙酰胺有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝等等作用6。當(dāng)煙酰胺缺乏時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞正常代謝不能正常進(jìn)行，糖原分解受阻等狀況而引發(fā)糙皮病。在市場(chǎng)上煙酰胺共分為三種：醫(yī)藥級(jí)、食品級(jí)和飼料。煙酰胺最主要作為營(yíng)養(yǎng)添加劑在飼料廣泛應(yīng)用，在食品和醫(yī)藥行業(yè)主要以維生素形式為人們所使用，煙酰胺在電鍍及生化方面也有一定的應(yīng)用7。醫(yī)學(xué)上常用來(lái)治療糙皮病、口炎、舌炎、肝臟疾病及日光性皮炎的藥物中均含有煙酰胺，其也被用來(lái)降低人體膽固醇和甘油三酯含量8。煙酰胺應(yīng)用最廣泛的

17、應(yīng)用是在飼料工業(yè)，其作為重要的飼料添加劑而被大量應(yīng)用9。1.1.5國(guó)外和國(guó)內(nèi)煙酰胺生產(chǎn)及消費(fèi)狀況 在20世紀(jì)50年代，國(guó)外煙酰胺的生產(chǎn)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)大批量生產(chǎn)。目前全世界煙酰胺的總產(chǎn)能約為30 kt/a，總產(chǎn)量也突破了20 kt/a10。世界上瑞士、美國(guó)、比利時(shí)、印度、西班牙等國(guó)家為煙酰胺主要產(chǎn)出國(guó)等，瑞士龍沙公司（LONZA）、美國(guó)Nepera公司、比利時(shí)Reilly Tor AG公司等是煙酰胺生產(chǎn)方面巨頭，這些企業(yè)年產(chǎn)能均在千噸以上，瑞士Lonza公司以35 %的生產(chǎn)能力位于煙酰胺生產(chǎn)行業(yè)的首位。煙酰胺消費(fèi)有40 %50 %作為飼料添加劑應(yīng)用在飼料生產(chǎn)方面；25 %30 %應(yīng)用于食品生產(chǎn)加工

18、；20 %25 %應(yīng)用于醫(yī)藥生產(chǎn)方面。美國(guó)年均消費(fèi)煙酰胺量在約10000 t以上，占世界消費(fèi)總量的一半，消費(fèi)中的80 %作為飼料添加劑使用。西歐的煙酰胺消費(fèi)量也很大。煙酰胺主要出口于日本。隨著第三世界國(guó)家飼料等工業(yè)的高速發(fā)展，煙酰胺消費(fèi)量正以每年超過(guò)5 %的速度快速增長(zhǎng)12。我國(guó)在20世紀(jì)50年代初開始進(jìn)行煙酰胺的生產(chǎn)，首家進(jìn)行煙酰胺生產(chǎn)的企業(yè)位于上海。我國(guó)在70年代的煙酰胺的年產(chǎn)量?jī)H在100左右，由于此時(shí)我國(guó)煙酰胺的生產(chǎn)還處于剛起步階段，在設(shè)備、規(guī)模等方面還存在著很大的不足。90年代初，隨著國(guó)外先進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)的引進(jìn)，中國(guó)出現(xiàn)了多家從事大規(guī)模生產(chǎn)煙酰胺的企業(yè)，比較著名的有南通醋酸化工股份有限公司

19、、廣州龍沙精細(xì)化工有限公司、浙江富陽(yáng)勝大生化科技有限公司、山東濰坊一邦化工科技有限公司等13。其中廣州龍沙有限公司是最早引進(jìn)國(guó)外先進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行煙酰胺大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)，它是由中國(guó)廣藥和瑞士龍沙雙方合資建設(shè)而成，年產(chǎn)煙酰胺達(dá)3400 t。到20世紀(jì)初期，我國(guó)煙酰胺年生產(chǎn)能力超過(guò)8000 t的企業(yè)已有6家，并且實(shí)現(xiàn)了對(duì)東南亞地區(qū)的規(guī)模性輸出 14。和國(guó)外煙酰胺應(yīng)用一樣，我國(guó)所消費(fèi)的煙酰胺主要用于飼料工業(yè)，比重占到總消費(fèi)量的約80 %。1.2煙酰胺生產(chǎn)工藝1.2.1煙酰胺的化學(xué)合成法 利用化學(xué)合成法進(jìn)行煙酰胺的生產(chǎn)依舊是目前工業(yè)上的主流工藝?；瘜W(xué)合成工藝的原材料主要是吡啶類物質(zhì)，主要利用各種化學(xué)物質(zhì)

20、與吡啶類物質(zhì)的氧化反應(yīng)來(lái)生產(chǎn)煙酰胺。應(yīng)用氧化方法首先得到煙腈，之后將煙腈在合適條件下進(jìn)行堿水解得到煙酰胺1517。在氧化生產(chǎn)過(guò)程中，吡啶類物質(zhì)與煙酰胺的原料產(chǎn)出比約為0.95:1，因此工業(yè)上煙酰胺產(chǎn)量的決定性因素依舊是原材料物質(zhì)的產(chǎn)量。1.2.2煙酰胺的微生物發(fā)酵法 與化學(xué)工藝相比，煙酰胺的微生物生產(chǎn)法有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：（1）反應(yīng)條件溫和，通常在常溫常壓下既能完成，沒(méi)有爆炸、污染嚴(yán)重等問(wèn)題。（2）原材料物質(zhì)易得且廉價(jià)。微生物發(fā)酵所用的原料通常為淀粉、糖蜜或者其他農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，不需要精制處理即可直接用于發(fā)酵生產(chǎn)。（3）微生物的自主調(diào)控。微生物參與的反應(yīng)一般都有自身的酶系或者代謝機(jī)制調(diào)解完成，無(wú)需過(guò)多

21、的認(rèn)為參與。（4）高度的專一性和選擇性。由于微生物體內(nèi)的酶具有專一性，因此微生物本身能夠?qū)Ｒ恍缘膶?duì)某些復(fù)雜化合物進(jìn)行特定部位等的氧化、還原、官能團(tuán)導(dǎo)入等等反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)。（5）環(huán)境污染小。微生物發(fā)酵工業(yè)的“三廢”對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)生物體也基本無(wú)害。這是微生物發(fā)酵相比于一般發(fā)酵最為顯著地優(yōu)越性。（6）此方法投資較小，見(jiàn)效較快，并且在效益方面潛力巨大。因此，針對(duì)煙酰胺生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)煙酰胺具有非常重大的意義，這也將改變煙酰胺生產(chǎn)工業(yè)長(zhǎng)久以來(lái)的一些難以改變的不利因素18。法國(guó)研究員Galzy及其研究組最早提出了煙酰胺的微生物發(fā)酵方法19，并且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中確定了煙酰胺發(fā)酵的菌株。此后通過(guò)對(duì)

22、微生物轉(zhuǎn)化腈類物質(zhì)必須的腈水合酶進(jìn)行進(jìn)一步研究，通過(guò)研究得出腈水合酶參與反應(yīng)所需最佳條件，該公司實(shí)現(xiàn)了腈水合酶活力的不斷提高，并讓丙烯酰胺產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)三次大幅度提高，到21世紀(jì)初期，丙烯酰胺產(chǎn)量已經(jīng)提高到20000 t/a。我國(guó)利用腈類物質(zhì)進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)起始于90年代中期，利用微生物轉(zhuǎn)化腈類物質(zhì)進(jìn)行丙烯酰胺生產(chǎn)的知名企業(yè)有江蘇如皋化肥廠，江西南昌農(nóng)科化工有限公司 20。1.3腈水合酶簡(jiǎn)介1.3.1腈水合酶在微生物界的分布腈類化合物一般是由與工業(yè)生產(chǎn)中某些物質(zhì)間的反應(yīng)所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，這些物質(zhì)一般具有很高的毒性，存在于工業(yè)廢水，腈類物質(zhì)很難被分解掉，而微生物體內(nèi)腈水合酶是腈類物質(zhì)最好的催化劑。腈類物質(zhì)對(duì)

23、人體來(lái)說(shuō)毒性較強(qiáng)，但是這種物質(zhì)卻可以作為碳源或者氮源為微生物所利用。自然界中存在的能夠利用腈類物質(zhì)的微生物種類很多，但一般利用率非常低，后來(lái)科學(xué)家們將這些微生物進(jìn)行人工馴化培養(yǎng)，通過(guò)改變微生物生長(zhǎng)條件及代謝機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了微生物腈水合酶活性的提高。腈水合酶主要存在于短桿菌屬、小球菌屬及諾卡氏菌屬等等。這些菌屬中常用的微生物菌株有：Nocardia sp.9611，Brevibacterium imperialis CBS489-74，Rhodocaccus rhodochrous JI， Corynebacterium pseudodiphterium ZBB-41，Breviterium R31

24、2，Rhodocaccus sp.N-774，Rhodocaccus sp. YH3-3，Alcaligenes faecalis ARCC8750，Alcaligenes faecalis JM，Pseudonocarda thermophila JCM3095，Becillus sp.BR449，Brecterium sp.CH2 等2125。廣泛分布的含腈水合酶微生物有著它們的相似之處：腈水合酶必須通過(guò)澳合作用與特定的金屬離子結(jié)合后才能表現(xiàn)出酶活性，在無(wú)金屬離子螯合情況下酶活基本為零或者極低。目前已發(fā)現(xiàn)的能與腈水合酶發(fā)生螯合作用的螯合因子主要有鐵離子和鈷離子。含有鈷型腈水合酶的微生物菌株

25、常見(jiàn)的有Rhodococcus rhodochrous JI，Pseudonocarda thermophila JCM3095等；含有鐵型腈水合酶的微生物菌株常見(jiàn)的有Corynebacterium pseudodiphteriumZBB-41等26。1.3.2腈水合酶的生物調(diào)控能與鈷離子螯合的腈水合酶是由和兩個(gè)亞基組成的組成的一種水溶性蛋白物質(zhì)，由于酶蛋白產(chǎn)生過(guò)程中誘導(dǎo)因子的不同，兩個(gè)亞基具有了不同的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了不同種類微生物內(nèi)腈水合酶分子量的差異，例如菌株Rhodococcus sp.N-774體內(nèi)腈水合酶分子量為70 KDa，而菌株Rhodococcus rhodochrous JI

26、 體內(nèi)的腈水合酶則有520 KDa和130 KDa兩種大小27。研究中發(fā)現(xiàn)高酰胺類物質(zhì)生產(chǎn)能力隨著腈水合酶分子量的不同而出現(xiàn)不同，一般認(rèn)為高分子量腈水合酶更適合酰胺生產(chǎn)，這主要是由它的高穩(wěn)定性和高活性決定的。 腈水合酶為誘導(dǎo)酶，在特定誘導(dǎo)劑存在下才能產(chǎn)生腈水合酶，以鈷型腈水合酶為例，菌體培養(yǎng)期間腈水合酶的酶活性和其含量只有在有鈷離子存在情況下才會(huì)有提高。X射線衍射實(shí)驗(yàn)表明，輔助因子鈷離子與2個(gè)N原子（酰胺基團(tuán)）和3個(gè)S原子（半胱氨酸硫醇鹽）形成5個(gè)配位鍵。在透析實(shí)驗(yàn)中游離鈷離子全部消失，說(shuō)明酶活性部位已將它們?nèi)拷Y(jié)合并在螯合作用下轉(zhuǎn)化為自身重要的一環(huán)，由此可見(jiàn)鈷離子對(duì)腈水合酶的重要性。從決定腈

27、水合酶的基因開始，當(dāng)基因的擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程全部完成后，得到的腈水合酶必須結(jié)合鈷離子才能實(shí)現(xiàn)其催化活性，這是我們進(jìn)行理論研究的重要基礎(chǔ)。1.3.3腈水合酶的反應(yīng)機(jī)理 鈷型腈水合酶的酶催化反應(yīng)的整個(gè)催化機(jī)制已經(jīng)得到了透徹的研究.當(dāng)鈷離子進(jìn)入腈類溶液后，水分子、原料中的腈分子和鈷離子三者相互結(jié)合，氰基中的C-N三鍵在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)激活并發(fā)生水合反應(yīng)，使得-OH基攻擊氰基并與其中C-離子形成一個(gè)亞酰胺R-C(-OH)=NH，異構(gòu)化后的亞酰胺即為酰胺類物質(zhì) 28。 1.4課題研究意義 煙酰胺作為B族維生素的重要成員，也是機(jī)體輔酶的重要組成部分。醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料等等領(lǐng)域都有非常廣泛的應(yīng)用。隨著

28、社會(huì)的發(fā)展，目前煙酰胺在化妝品生產(chǎn)行業(yè)也得到了應(yīng)用，而其他各行業(yè)對(duì)煙酰胺的需求量也在繼續(xù)增加。因此，在工業(yè)中如何有效提高煙酰胺的產(chǎn)量成為人們重視的一個(gè)問(wèn)題。利用微生物法生產(chǎn)煙酰胺是煙酰胺生產(chǎn)的一個(gè)重要工藝，它具有化工合成生產(chǎn)不具備的巨大優(yōu)勢(shì)。在此工藝中，微生物菌種的活性決定了煙酰胺的產(chǎn)量。因此，高腈水合酶活力生產(chǎn)菌株的篩選對(duì)煙酰胺生產(chǎn)具有重要意義。在生產(chǎn)過(guò)程中，人們應(yīng)該適時(shí)的對(duì)煙酰胺產(chǎn)量及品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，因此確立一種快速有效的檢測(cè)手段對(duì)煙酰胺生產(chǎn)也具有重要意義。1.5課題研究?jī)?nèi)容本課題主要從實(shí)驗(yàn)室已有菌種出發(fā)，利用現(xiàn)有設(shè)備、儀器、藥品及方法并參閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，獨(dú)立完成了以下幾方面研究工作：1.5

29、.1高腈水合酶活力菌株的篩選 利用實(shí)驗(yàn)室已具備的各種條件及儀器設(shè)備，參閱相關(guān)資料文獻(xiàn)，研究ARTP、微波、甲基磺酸乙酯(EMS)三種誘變劑對(duì)實(shí)驗(yàn)中出發(fā)菌株中腈水合酶活力的影響，確定了菌種誘變過(guò)程中三種誘變劑各自的最佳誘變條件。在單因素誘變的基礎(chǔ)上進(jìn)行三種影響因素的復(fù)合誘變實(shí)驗(yàn)，通過(guò)不斷的嘗試與篩選，最終選育出具有高酶活性的煙酰胺產(chǎn)生菌株。1.5.2煙酰胺的HPLC檢測(cè)條件優(yōu)化。 利用高效液相色譜進(jìn)行煙酰胺檢測(cè)，在現(xiàn)有檢測(cè)條件的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)高效液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相比例、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相流量、進(jìn)樣量等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定出煙酰胺檢測(cè)最佳的檢測(cè)條件。1.5.3煙酰胺高產(chǎn)菌株酶催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

30、通過(guò)對(duì)菌體濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度、PH和菌齡時(shí)間五個(gè)因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最佳的酶反應(yīng)條件。2 材料與方法2.1 材料2.1.1菌種 諾卡氏菌HD1220，河南大學(xué)生命科學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。2.1.2培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基（g/L）： 葡萄糖10， 酵母膏5，NaCl 1，K2HPO4 2，瓊脂 20，pH 7.5，115 滅菌15 min。 篩選培養(yǎng)基（g/L）：3-氰基吡啶 8，葡萄糖 15，酵母膏 3，NaCl 1，MgSO4 0.2，K2HPO4 0.5，瓊脂 15，pH 7.5，115 滅菌15 min。種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 15，酵母膏 6，尿素 6，KH2PO4 0.5，

31、K2HPO4 0.5，MgSO47H2O 0.2，谷氨酸鈉 1，pH 7.5，115 滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，酵母膏 9，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MgSO47H2O 0.5，谷氨酸鈉 1，脲 7，鈷離子 12 mg，pH 7.5，115 滅菌15 min。2.1.3主要試劑 在試驗(yàn)中應(yīng)用到的主要試劑的規(guī)格以及生產(chǎn)廠家如下表1-1所示：表2-1 主要試劑規(guī)格及生產(chǎn)廠家Tab.2-1 Specifications and manufacturers of main reagent試劑名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家葡萄糖分析純天津德恩化學(xué)試劑有限公司酵母膏生化級(jí)北

32、京奧博星生物技術(shù)公司脲分析純鄭州派尼化學(xué)試劑廠磷酸二氫鉀分析純天津科密歐化學(xué)試劑有限公司磷酸氫二鉀分析純天津科密歐化學(xué)試劑有限公司硫酸鎂分析純天津科密歐化學(xué)試劑有限公司谷氨酸鈉分析純天津化學(xué)試劑六廠氯化鈷分析純天津德恩化學(xué)試劑有限公司甲醇色譜級(jí)西隴化工股份有限公司鹽酸分析純開封東大化工試劑廠3-氰基吡啶化學(xué)級(jí)鄭州派尼化學(xué)試劑廠氯化鈉分析純天機(jī)科密歐化學(xué)試劑有限公司瓊脂食品級(jí)福建莆田聯(lián)邦瓊脂有限公司氫氧化鈉分析純鄭州派尼化學(xué)試劑廠酒石酸鉀鈉分析純天津德恩化學(xué)試劑有限公司苯酚生化級(jí)天津德恩化學(xué)試劑有限公司2.1.4主要儀器在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用到的主要儀器如表1-2所示：表2-2 主要儀器型號(hào)及生產(chǎn)廠家

33、Tab.2-2 Types and manufacturers of main equipments儀器名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家高效液相色譜儀Waters-1525美國(guó)Waters公司常壓等離子體誘變育種儀北京思情源生物科技有限公司全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋SX-500日本TOMY公司潔凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床ZWY-2102上海智城分析儀器有限公司電子天平FA124上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司移液器DV-04123大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司微波爐KJ23B-DE廣東美的微波爐制造有限公司水浴鍋HH-6國(guó)華電器有限公司紫外分光光度計(jì)752N上海儀電分析儀器有限公司臺(tái)式高速冷

34、凍離心機(jī)5810R德國(guó)Eppendorf股份公司循環(huán)水式多用真空泵SHB-III鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA上海亞榮生化儀器廠2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1菌種培養(yǎng)方法 菌種活化：將保藏于超低溫冰箱中的菌種取出，在30 條件下放置10 min，之后進(jìn)行梯度稀釋涂布平板，之后置于30 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 斜面培養(yǎng)：挑取平板上面生長(zhǎng)情況良好的菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。液體種子培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)菌種取一環(huán)接入液體種子培養(yǎng)基，之后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ，搖瓶裝液量為30 mL，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為36 h。液

35、體發(fā)酵培養(yǎng)基：將培養(yǎng)好的種子液以5 %接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ，搖瓶裝液量為30 mL，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。2.2.2高酶活煙酰胺生產(chǎn)菌種的誘變及選育(1)等離子體誘變等離子體主要指電離氣體，只有當(dāng)帶電粒子密度達(dá)到其建立的空間電荷足以限制其自身運(yùn)動(dòng)時(shí)，帶電粒子才會(huì)影響整個(gè)體系的性質(zhì)，此時(shí)才會(huì)形成等離子體29。當(dāng)氣體經(jīng)過(guò)電場(chǎng)作用后，基態(tài)原子在電子動(dòng)能、粒子碰撞的作用下向高能級(jí)躍遷稱為激發(fā)態(tài)。在此過(guò)程中，電子、光子、正負(fù)離子得以形成。等離子體主要是氣體在加熱或者強(qiáng)電磁場(chǎng)作用下電離產(chǎn)生的，主要由電子、離子、原子、分子、活性自由基及射線等組成。其中的活性自

36、由基及射線，如紫外線、射線等對(duì)微生物具有很強(qiáng)的滅殺作用。近20年來(lái)，隨著人們對(duì)等離子體研究的日益深入，它在滅菌和生物誘變方面的應(yīng)用也引起了人們的關(guān)注。比較普遍采用的等離子體消毒裝置有高頻電磁場(chǎng)、激光和微波等離子體，等離子云有空氣、氦氣、氮?dú)?、氧氣、鹵素氣體等，所研究的微生物有大腸桿菌、釀酒酵母、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草桿菌等3133。根據(jù)等離子體的各種性質(zhì)，我們對(duì)具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行了設(shè)計(jì)，具體流程如下：(1) 常溫等離子體誘變出發(fā)菌株的制備本實(shí)驗(yàn)誘變所用菌株為諾卡氏菌HD1220，保藏于溫度為70 的超低溫冰箱中。將出發(fā)菌株從超低溫冰箱中取出在平板上活化，在30 培養(yǎng)48 h，之后轉(zhuǎn)接兩

37、代，從第三代生長(zhǎng)良好的平板中挑出菌落最大、長(zhǎng)勢(shì)最好的菌落作為出發(fā)菌株，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)48 h之后，在200 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上震蕩培養(yǎng)36 h，將培養(yǎng)好的種子液用0.8%生理鹽水進(jìn)行稀釋，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板鏡檢實(shí)驗(yàn)使菌液濃度控制在108 個(gè)/mL。(2) 等離子體誘變 本實(shí)驗(yàn)所使用的誘變?cè)O(shè)備是北京思情源生物科技有限公司生產(chǎn)的常壓等離子體誘變育種儀。該儀器所使用的氣體為氦氣，在使用前需先設(shè)定氣體流量為10 mL/min，打開紫外燈殺菌處理20 min。 取經(jīng)過(guò)稀釋處理的菌液10 L置于誘變專用的載片上，涂抹均勻制成菌膜后進(jìn)行誘變處理。本裝置采用紫外滅菌，以空氣為傳導(dǎo)介質(zhì)，在常壓下，滅菌室內(nèi)電極經(jīng)過(guò)

38、特定條件激發(fā)產(chǎn)生輝光放電形成等離子體。在射頻功率300 W下以60 s為梯度，對(duì)樣品分別進(jìn)行60 s、120 s、180 s、240 s、300 s、360 s的誘變處理，誘變后樣品放入1 mL EP管內(nèi)，加入1 mL無(wú)菌生理鹽水震蕩洗脫，將洗脫液稀釋成10-110-7的濃度梯度，取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂布平板，30培養(yǎng)48 h后對(duì)平板菌落進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，以每皿菌落數(shù)在100左右為最佳濃度，從而計(jì)算出不同誘變時(shí)間所對(duì)應(yīng)的致死率情況。致死率計(jì)算公式為： 致死率=100%存活率 存活率=(誘變后存活菌落數(shù)相應(yīng)稀釋倍數(shù)) (對(duì)照平板菌落數(shù)相應(yīng)稀釋倍數(shù))根據(jù)致死率與誘變時(shí)間對(duì)應(yīng)關(guān)系，我

39、們可以制作出致死率曲線。(3)高產(chǎn)菌株初篩在各個(gè)誘變時(shí)間相對(duì)應(yīng)的平板上分別挑出30株不同形態(tài)的菌落及一株不經(jīng)過(guò)誘變處理的平板菌落接斜面在30 條件下培養(yǎng)48 h，之后轉(zhuǎn)接種子瓶培養(yǎng)36 h后，以5 %接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)48h測(cè)定配活力，規(guī)定誘變后酶活高于出發(fā)菌株且酶活為其1.1倍以上的突變株定義為正突變株，酶活低于出發(fā)菌株且酶活為其0.9倍以下的突變株定義為負(fù)突變株。然后對(duì)突變株的突變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選擇最高正突變率所對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)作為誘變處理時(shí)間。正突變率的計(jì)算方法為：正突變率=正突變菌株數(shù)突變株總數(shù)100%(2)微波誘變利用微波進(jìn)行菌種誘變是一種新興的誘變手段、微波誘變主

40、要利用微波的輻射作用，微波輻射是一種低能的電磁輻射，在誘變育種領(lǐng)域，它對(duì)微生物具有較強(qiáng)的生物效應(yīng)，這種生物效應(yīng)主要包括兩個(gè)方面：熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。熱效應(yīng)主要是指在一定功率和一定頻率下，通過(guò)電磁輻射對(duì)微生物進(jìn)行照射，引起局部溫度上升，從而引起微生物體內(nèi)一些生理生化反應(yīng)的變化，甚至死亡；非熱效應(yīng)是指在電磁波作用下，特別是在長(zhǎng)時(shí)間及低溫的電磁場(chǎng)作用下，生物體并沒(méi)有明顯的溫度變化，或者生物體自身溫度變化在自然范圍內(nèi)，但卻可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的生物效應(yīng)，并在生物體內(nèi)產(chǎn)生各種生理，生化功能的變化，表現(xiàn)為頻率和功率的選擇性上。由于微波這兩種效應(yīng)的存在，從而可以引起生物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的正突變效應(yīng)和負(fù)突變效應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)

41、中，菌種誘變所使用的微波爐為廣東美的公司制造的型號(hào)為KJ23B-DE型微波爐，微波輸出功率800 W，頻率為2450 MHz。微波爐具有低火、中低火、中火、中高火、高火五種不同的檔位，如果設(shè)定高火檔位為100 %，那么其他四種檔位按照先后順序分別為80 %、60 %、40 %、20 %。在實(shí)驗(yàn)中，我們從不同的照射強(qiáng)度和不同的照射時(shí)間兩個(gè)方面進(jìn)行菌種的誘變。為了確定微波誘變最佳輸出功率，我們?cè)O(shè)定在照射時(shí)間為60 s時(shí)，取經(jīng)過(guò)稀釋的菌懸液5 mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，開蓋放入微波爐，設(shè)定微波爐輸出頻率分別為20 %、40 %、60 %、80 %、100 %進(jìn)行照射處理，之后在4冰箱中放置2 h以減少回復(fù)

42、突變，然后進(jìn)行平板培養(yǎng)，并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。對(duì)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的誘變菌株進(jìn)行存活率及正負(fù)突變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最終確定出最佳照射強(qiáng)度。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們確定了最佳照射強(qiáng)度，在此基礎(chǔ)上，將裝有5mL稀釋菌液的培養(yǎng)皿開蓋置于微波爐中，設(shè)定照射時(shí)間分別為30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，進(jìn)行誘變處理。將誘變后菌種在冰箱中冷藏2 h后進(jìn)行固體培養(yǎng)并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌株存活率及正負(fù)突變率，最終確定最佳照射時(shí)間。(3)甲基磺酸乙酯誘變甲基磺酸乙酯是一種在微生物育種領(lǐng)域常用的化學(xué)誘變劑，簡(jiǎn)稱EMS。EMS是一種重要的致癌物，在生物學(xué)上，EMS常用作突變體庫(kù)的建立、微生物育種等。EMS對(duì)微

43、生物具有誘變效應(yīng)的機(jī)理主要是EMS能使基因中的鳥嘌呤烷基化，并使烷基化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì)，代替了胞嘧啶，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)換型突變效應(yīng)，另外，由于鳥嘌呤烷基活化導(dǎo)致糖苷鍵斷裂造成在DNA復(fù)制過(guò)程中堿基對(duì)發(fā)生替換。EMS誘發(fā)的這種染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量方面的變化是其誘變效應(yīng)的主要表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)選用EMS作為誘變因子，首先要確定EMS的濃度，由于EMS為液體物質(zhì)，我們需要從EMS母液出發(fā)進(jìn)行稀釋。取0.5 mL EMS溶解于9.5 mL PH為7.2的磷酸緩沖液，將其配置成體積分?jǐn)?shù)為5 %的EMS母液，震蕩搖勻后待用。分別取不同體積的菌液，將其與EMS母液進(jìn)行混合，混合后濃度分別為0.2 %、0.4 %、0.

44、6 %、0.8 %、1.0 %、1.2 %，將混合液裝入無(wú)菌三角瓶中，在30 下置于震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)30 h，最后加入一定量的2 %硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。將誘變后菌種進(jìn)行固體培養(yǎng)并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)誘變后菌種的存活率和正負(fù)突變率，確定最佳EMS濃度。（4）復(fù)合誘變?cè)谡T變育種過(guò)程中，如果對(duì)同一菌株進(jìn)行長(zhǎng)期的單一因子誘變，會(huì)使該菌種對(duì)誘變劑產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”，從而會(huì)是誘變效果大大降低。單一誘變因子的長(zhǎng)期使用會(huì)改變菌株的某些生理特性，比如可能會(huì)使菌株生長(zhǎng)緩慢，代謝效率降低，對(duì)于真菌會(huì)導(dǎo)致孢子產(chǎn)生量減少，這些負(fù)面效應(yīng)不利于發(fā)酵工藝的控制。在實(shí)際生產(chǎn)中，復(fù)合誘變能有效的減少這些負(fù)面效應(yīng)。復(fù)合誘變包括多種

45、誘變劑的先后使用，同一種誘變劑的重復(fù)使用和多種誘變劑的同時(shí)使用。人們普遍認(rèn)為，復(fù)合誘變具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，多種誘變劑的合理搭配及使用效果要明顯優(yōu)于單一誘變劑的誘變效果。在本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合誘變實(shí)在單因子誘變基礎(chǔ)上進(jìn)行的，復(fù)合誘變所使用誘變劑分別為等離子體、微波和EMS三種因子。取5 mL稀釋過(guò)的菌懸液加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，分別利用以上三種誘變因子在已確定的最佳條件下進(jìn)行第一次誘變處理。誘變后，將菌液混合均勻，并將其分成兩部分，一部分在30 、200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)8 h后，利用甘油保藏法進(jìn)行超低溫冷凍保藏，一部分作為出發(fā)菌株分別在三個(gè)誘變因子最佳誘變條件下進(jìn)行第二次誘變，如同第一次操作，第

46、二次誘變所得菌液也分成兩部分，一部分保藏，另一部分作為出發(fā)菌株進(jìn)行第三次誘變處理，將所得菌液進(jìn)行超低溫冷凍保藏。誘變操作完成后，將第一次、第二次、第三次分別保藏的突變菌株進(jìn)行稀釋，涂布于含有80 g/L 3-氰基吡啶的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種篩選，挑選生長(zhǎng)狀況良好的菌株轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基在30 、220 r/min條件下進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，篩選出高酶活菌株，并進(jìn)行及時(shí)保藏。(5)遺傳穩(wěn)定性測(cè)定為保證誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性，減少回復(fù)突變對(duì)菌株酶活帶來(lái)的負(fù)面影響，我們需將挑選出來(lái)的酶活性最高的3株菌株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，每代菌株在30 條件下培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)6 次，測(cè)定每次傳代菌株的酶活，并將遺傳穩(wěn)定性

47、變化圖繪制成曲線圖。根據(jù)遺傳穩(wěn)定性曲線圖挑選出穩(wěn)定性良好的菌株進(jìn)行保藏，保藏于設(shè)定溫度為70 的超低溫冰箱中。(6)菌株酶活性測(cè)定方法在測(cè)定菌株酶活性高低時(shí)，我們需要嚴(yán)格控制酶反應(yīng)的時(shí)間和參與反應(yīng)酶的量。我們定義1 mL發(fā)酵液在1 min內(nèi)催化3-氰基吡啶生成1 mol煙酰胺所需的腈水合酶的數(shù)量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。測(cè)定腈水合酶的酶活時(shí)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程是在磷酸緩沖液中進(jìn)行。將發(fā)酵液進(jìn)行離心，磷酸緩沖液洗滌兩次后，取1 mL菌懸液加入到9 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的3-氰基吡啶溶液，再向混合溶液中加入10 mL磷酸緩沖液，混勻后置于30 條件下震蕩反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后用6 mol/L鹽酸溶

48、液終止反應(yīng)。利用HPLC測(cè)定腈水合酶的沒(méi)活力。 2.2.3HPLC檢測(cè)煙酰胺條件的優(yōu)化目前在煙酰胺檢測(cè)方面最準(zhǔn)確的方法是高效液相色譜檢測(cè)法。高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又稱“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“高壓液相色譜”。高效液相色譜技術(shù)使色譜技術(shù)的一個(gè)重要分支，其所用的流動(dòng)相為液態(tài)，利用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相進(jìn)入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)完成分離各成分的分離，再經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分析檢測(cè)34。和其他檢測(cè)技術(shù)相比，高效液相色譜有以下特點(diǎn)：（1）流動(dòng)相

49、為液體，在高壓作用下能使各成分快速完成分離。（2）分離效能高。（3）靈敏度高。檢測(cè)可達(dá)到納米級(jí)。（4）應(yīng)用范圍廣。在有機(jī)化合物中，70 %的物質(zhì)都能用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。（5）分析速度快。一般檢測(cè)通常能夠在幾分鐘到幾十分鐘內(nèi)完成，一般不超過(guò)一個(gè)小時(shí)。但高效液相色譜也有其缺點(diǎn)，高效液相色譜具有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬和柱效能的降低。目前高效液相色譜作為一種快速、準(zhǔn)確、直接的檢測(cè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，尤其是在藥品檢測(cè)方面。一般藥品成分都比較復(fù)雜，尤其是中藥成

50、分，檢測(cè)難度比較大。利用高效液相色譜技術(shù)能夠成功的對(duì)許多藥品的具體成分進(jìn)行分析測(cè)定，它也稱為目前藥品檢測(cè)采用的主流方法之一。在中國(guó)藥典中，使用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品已從80年代的7種增加到了2010年的2000余種。在生命科學(xué)領(lǐng)域，HPLC目前已成為生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家在分子水平研究生命科學(xué)、臨床化學(xué)、遺傳工程、分子生物學(xué)等必不可少的工具，其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在兩個(gè)方面：（1）低分子量物質(zhì)，如氨基酸，有機(jī)酸，糖類，卟啉類，有機(jī)胺類、維生素類等的分離測(cè)定。（2）高分子物質(zhì)，如多肽，蛋白質(zhì)、酶、核糖核酸等的純化、分離和測(cè)定。關(guān)于高效液相色譜檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)室目前暫時(shí)使用的檢測(cè)條件為：檢測(cè)所使

51、用的流動(dòng)相為甲醇和水，其比例為：甲醇：水=1：4，流動(dòng)相流速為0.3 mL/min，檢測(cè)樣品進(jìn)樣量為10 L，色譜柱柱溫為30 ，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm，色譜柱規(guī)格為C18柱。以上檢測(cè)條件均是經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。在此條件下，煙酰胺和3-氰基吡啶的檢出時(shí)間分別為13.776 min和25.968 min。如圖1-3所示：圖2-1 煙酰胺和3-氰基吡啶出峰時(shí)間圖Fig.2-1 The peak time of nicotinamide and 3-cyanopyridin 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為了獲得更好的檢測(cè)結(jié)果，我們需要從各個(gè)檢測(cè)條件入手，對(duì)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化處理，以期能在最短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出煙

52、酰胺的含量。(1) 繪制煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線 為了確定高效液相色譜檢測(cè)過(guò)程中檢出峰的峰面積與煙酰胺的含量是否具有良好的線性關(guān)系，我們需要繪制煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置0.025 g/L煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（用0.22 nm水系濾膜過(guò)濾），設(shè)定煙酰胺溶液進(jìn)樣量分別為5 L 、10 L，15 L，20 L，25 L，以煙酰胺進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，檢出峰的峰面積為縱坐標(biāo)繪(2) HPLC紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的確定為了確定煙酰胺檢測(cè)波長(zhǎng)，我們應(yīng)對(duì)煙酰胺及其生產(chǎn)所用底物3-氰基吡啶進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，確定兩者的紫外吸收峰后，為了得到最佳出峰效果，我們也要考慮在其他紫外波長(zhǎng)下煙酰胺的處峰情況，在實(shí)驗(yàn)中，我們選取200 nm、220 n

53、m、240 nm，260 nm五個(gè)紫外波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，觀察在每個(gè)紫外吸收波長(zhǎng)下煙酰胺的出峰情況，通過(guò)對(duì)比，選出最佳峰形所對(duì)應(yīng)的紫外吸收波長(zhǎng)作為煙酰胺檢測(cè)波長(zhǎng)。(3) HPLC流動(dòng)相流量的確定高效液相色譜檢測(cè)所使用的流動(dòng)相要是根據(jù)被檢測(cè)物質(zhì)的溶解性以及極性來(lái)確定的。被檢測(cè)物質(zhì)在流動(dòng)相中應(yīng)該有很好的溶解性，并且要求流動(dòng)相的洗脫能力要強(qiáng)，再者流動(dòng)相與稀釋液不應(yīng)再樣品的紫外吸收波長(zhǎng)處有吸收。HPLC檢測(cè)過(guò)程中，流動(dòng)相流量的大小會(huì)直接影響到檢測(cè)保留時(shí)間的長(zhǎng)短。選擇最佳的流動(dòng)相流量，不僅能優(yōu)化流動(dòng)相的使用量，更能使檢測(cè)時(shí)間縮短，檢測(cè)效果提高，這對(duì)檢測(cè)過(guò)程有著很重要的影響。在煙酰胺檢測(cè)過(guò)程中，我們分別設(shè)定流動(dòng)

54、相甲醇和水混合液的流速分別為0.1 mL/min、0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.4 mL/min、0.5 mL/min、0.6 mL/min六個(gè)不同的流量進(jìn)行試驗(yàn)，煙酰胺檢測(cè)出峰時(shí)間會(huì)有不同，我們將出峰時(shí)間短、檢測(cè)峰峰型最佳的流動(dòng)相流量作為煙酰胺檢測(cè)最適宜流動(dòng)相流量。(4) 高效液相色譜流動(dòng)相比例的確定煙酰胺的高效液相色譜檢測(cè)所使用的流動(dòng)相為甲醇和水的混合物。有機(jī)相的甲醇要求必須是色譜級(jí)檢測(cè)專用品。水相要求使用超純水，即蒸餾水除去幾乎所有離子雜質(zhì)。流動(dòng)相中甲醇和水的比例決定了對(duì)煙酰胺的洗脫能力及檢測(cè)所用時(shí)間。因此，確定最佳的流動(dòng)相比例對(duì)于煙酰胺的檢測(cè)具有非常重要的意義。在本實(shí)

55、驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)定了流動(dòng)相的比例分別為甲醇：水=1：7、1：5、1：3、1：1、四個(gè)不同流動(dòng)相比例進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)出峰時(shí)間的不同來(lái)確定最佳的流動(dòng)相比例。2.2.4煙酰胺的提取 煙酰胺在固體狀態(tài)下為白色結(jié)晶或者白色結(jié)晶粉末，在水中或者乙醇中有很高的溶解度。根據(jù)煙酰胺的物理性質(zhì)，我們?cè)O(shè)計(jì)了煙酰胺的提取過(guò)程并得到了煙酰胺的結(jié)晶。煙酰胺生產(chǎn)菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，離心處理3次，每次離心條件為4000 r/min、15 min，每次離心后棄去上清液并加入蒸餾水與菌體震蕩混勻。離心是為了對(duì)菌體進(jìn)行清洗，充分洗去菌體中的發(fā)酵液成分。取出菌體加入蒸餾水制成菌懸液，取5 mL菌懸液加入15 mL含有8 %的3-氰基

56、吡啶溶液中，在30 下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中充分震蕩，并檢測(cè)3-氰基吡啶反應(yīng)情況，當(dāng)確定3-氰基吡啶已反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液再次離心，棄去菌體沉淀。將所得上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后，加入20 mL無(wú)水乙醇將所得固體溶解。將溶液放入45 真空干燥箱中干燥后，對(duì)所得固體進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)煙酰胺的純度及收率進(jìn)行計(jì)算。2.2.5煙酰胺生產(chǎn)過(guò)程中酶催化反應(yīng)條件優(yōu)化在腈水合酶催化生產(chǎn)煙酰胺過(guò)程中，我們需要對(duì)轉(zhuǎn)化所需的各個(gè)條件加以控制，以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的生產(chǎn)。煙酰胺生產(chǎn)過(guò)程中的腈水合酶催化反應(yīng)所涉及的條件有：（1）微生物的菌齡。微生物法生產(chǎn)煙酰胺主要利用微生物體內(nèi)的腈水合酶，而微生物的菌齡影響著腈水合酶的活性，因此我

57、們需要在腈水合酶活性最高的微生物生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。（2）菌體濃度。為了保證菌體充分與底物接觸，實(shí)現(xiàn)底物充分利用，我們需要控制微生物菌體的濃度。菌體濃度過(guò)大將會(huì)使菌體不能充分接觸底物，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低，菌體濃度過(guò)小將會(huì)使生產(chǎn)時(shí)間延長(zhǎng)，降低生產(chǎn)效率。（3）溫度。溫度影響著腈水合酶的酶活性，為了保證菌體在高酶活情況下參加反應(yīng)，適宜的溫度是不可或缺的。（4）PH。微生物的生長(zhǎng)需要適宜的PH，腈水合酶在合適的Ph條件下才能保證較高酶活性。（5）底物濃度。煙酰胺生產(chǎn)所使用的底物3-氰基吡啶為一種劇毒性物質(zhì)，底物的毒性會(huì)降低微生物活性，從而降低腈水合酶的酶活性，選擇合適的底物濃度，不僅能降低底物對(duì)腈水合酶的影響，也能保證煙酰胺生產(chǎn)的高效進(jìn)行.(6)反應(yīng)時(shí)間。隨著酶反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底物的持續(xù)消耗以及產(chǎn)物的不斷積累，腈水合酶的活性也會(huì)出現(xiàn)一定的變化。(7)產(chǎn)物濃度。在酶反應(yīng)過(guò)程中，產(chǎn)物的不斷積累會(huì)對(duì)腈水合酶活性造成抑制效應(yīng)，從而降低腈水合酶的活性。 為了獲得煙酰胺生產(chǎn)最適宜的條件，我們影響腈水合酶活性的因素分別進(jìn)行試驗(yàn)，以期確定最佳的生產(chǎn)條件組合。酶催化體系：配置PH 7.2的磷酸緩沖液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為