總糖和還原糖的測(cè)定──費(fèi)林試劑比色法

1、實(shí)驗(yàn)一 總糖和還原糖的測(cè)定（一）費(fèi)林試劑比色法目的要求掌握還原糖和總糖的測(cè)定原理，學(xué)習(xí)用直接滴定法測(cè)定還原糖的方法。 實(shí)驗(yàn)原理 將一定量的堿性酒石酸銅甲液和乙液等體積混合時(shí)，硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)，生成氫氧化銅沉淀： 2NaOH + CuSO4 = Cu(OH)2 + Na2SO4 所生成的氫氧化銅沉淀與酒石酸鈉反應(yīng)，生成可溶性的酒石酸鉀鈉銅： COOKCOHHCOHCOONaHCOOKCOHCOCOONaHCu(OH)2+=Cu + 2H2 H2 O  在加熱條件下，用樣液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應(yīng)，酒石酸鉀鈉銅被還原糖還

2、原，產(chǎn)生紅色氧化亞銅沉淀，還原糖則被氧化和降解，其反應(yīng)如下：  反應(yīng)生成的氧化亞銅沉淀與費(fèi)林試劑中的亞鐵氰化鉀（黃血鹽）反應(yīng)生成可溶性復(fù)鹽，便于觀察滴定終點(diǎn)。 Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2O K2Cu2Fe(CN)6 + 2KOH（氧化亞銅） （淡黃色） 滴定時(shí)以亞甲基藍(lán)為氧化還原指示劑。因?yàn)閬喖谆{(lán)氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅離子全部被還原后，稍過(guò)量的還原糖可使藍(lán)色的氧化型亞甲基藍(lán)還原為無(wú)色的還原型的亞甲基藍(lán)，即達(dá)滴定終點(diǎn)。根據(jù)樣液量可計(jì)算出還原糖含量。  試劑和器材 一、試劑堿性酒石酸銅甲液：稱取15g硫酸銅（CuS

3、O4·5H2O）及亞甲基藍(lán)，溶于蒸餾水中并稀釋到1000ml。堿性酒石酸銅乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉及75g NaOH，溶于蒸餾水中，再加入4g亞鐵氰化鉀K4Fe（CN）6，完全溶解后，用蒸餾水稀釋到1000ml，貯存于具橡皮塞玻璃瓶中。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)98100干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖，加蒸餾水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml濃HCl（防止微生物生長(zhǎng)），用蒸餾水稀釋到1000ml。6mol/LHCl：取250ml濃HCl（35%38%）用蒸餾水稀釋到500ml。碘碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。6N NaOH：稱取120gNaOH溶于5

4、00ml蒸餾水中。0.1%酚酞指示劑。二、材料山芋粉 三、器材電熱恒溫水浴鍋，調(diào)溫電爐，250ml錐形瓶，滴定管。 操作方法 一、樣品中還原糖的提取準(zhǔn)確稱取 2g山芋粉，放在100ml燒杯中，先以少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50ml蒸餾水，混勻，于50恒溫水浴中保溫20min，不時(shí)攪拌，使還原糖浸出混。過(guò)濾，將濾液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。二、樣品中總糖的水解及提取準(zhǔn)確稱取1g山芋粉，放在錐形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸餾水15ml，在沸水浴中加熱，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完

5、全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。水解畢。冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100ml，過(guò)濾取濾液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測(cè)定。三、堿性酒石酸銅溶液的標(biāo)定準(zhǔn)確吸取堿性酒石酸銅甲液和乙液各，置于250ml錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒。從滴定管滴加約9ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加熱使其在2min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30s，趁熱以每2s 1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積。平行操作3次，取其平均值，按下式計(jì)算： 式中：F10ml堿性酒

6、石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的量，mg； C葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/ml； V標(biāo)定時(shí)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，ml。四、樣品糖的定量測(cè)定(1) 樣品溶液預(yù)測(cè)定：吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各，置于250ml錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，加熱使其在2min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30s，趁熱以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄樣品溶液消耗的體積。(2) 樣品溶液測(cè)定：吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各，置于錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，從滴定管中加入比與測(cè)試樣品溶液消耗的總體積

7、少1ml的樣品溶液，加熱使其在2min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30s，趁熱以每2s 1滴的速度繼續(xù)滴加樣液，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗樣品溶液的總體積。平行操作3次，取其平均值。五、結(jié)果處理其中：m樣品重量，g；式中：F10ml堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的量，mg；V標(biāo)定時(shí)平均消耗還原糖或總糖樣品溶液的總體積，mlV1還原糖或總糖樣品溶液的總體積，ml；1000mg換算成g的系數(shù)。  注意事項(xiàng) （1）本法是根據(jù)一定量的堿性酒石酸銅溶液（Cu2量固定）消耗的樣液量來(lái)計(jì)算樣液中還原糖含量，反應(yīng)體系中Cu2的含量是定量的基礎(chǔ)，所以在樣品處理時(shí)，不能用銅鹽作為澄清劑，以免

8、樣液中引入Cu2，得到錯(cuò)誤的結(jié)果。（2）堿性酒石酸銅甲液和乙液應(yīng)分別貯存，用時(shí)才混合，否則酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物長(zhǎng)期在堿性條件下會(huì)慢慢分解析出氧化亞銅沉淀，使試劑有效濃度降低。（3）滴定必須是在沸騰條件下進(jìn)行，其原因一是加快還原糖與Cu2的反應(yīng)速度；二是亞甲基藍(lán)的變色反應(yīng)是可逆的，還原型的亞甲基藍(lán)遇空氣中的氧時(shí)會(huì)再被氧化為氧化型。此外，氧化亞銅也極不穩(wěn)定，易被空氣中的氧所氧化。保持反應(yīng)液沸騰可防止空氣進(jìn)入，避免亞甲基藍(lán)和氧化亞銅被氧化而增加消耗量。（4）滴定時(shí)不能隨意搖動(dòng)錐形瓶，更不能把錐形瓶從熱源上取下來(lái)滴定，以防止空氣進(jìn)入反應(yīng)溶液中。（5）樣品溶液應(yīng)預(yù)測(cè)，其目的：一是本法對(duì)樣品溶液中還原糖濃度

9、有一定要求（0.1%左右），測(cè)定時(shí)樣品溶液的消耗體積應(yīng)與標(biāo)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)消耗的體積相近，通過(guò)預(yù)測(cè)可了解樣品溶液濃度是否合適，濃度過(guò)大或過(guò)小應(yīng)加以調(diào)整，使預(yù)測(cè)時(shí)消耗樣液量在10ml左右；二是通過(guò)預(yù)測(cè)可以知道樣液大概消耗量，以便在正式測(cè)定時(shí)，預(yù)先加入比實(shí)際用量少1ml左右的樣液，只留下1ml左右樣液在繼續(xù)滴定時(shí)加入，以保證在1分鐘之內(nèi)完成繼續(xù)滴定工作，提高測(cè)定的準(zhǔn)確度。（6）必須嚴(yán)格控制反應(yīng)液的體積，標(biāo)定和測(cè)定時(shí)消耗的體積應(yīng)接近，使反應(yīng)體系堿度一致。熱原一般采用800W電爐，電爐溫度恒定后才能加熱，熱原強(qiáng)度應(yīng)控制在使反應(yīng)液在兩分鐘內(nèi)沸騰，且應(yīng)保持一致；否則加熱至沸騰所需時(shí)間就會(huì)不同，引起蒸發(fā)量不同，使反應(yīng)液堿度發(fā)生變化，從而引入誤差。沸騰時(shí)間和滴定速度對(duì)結(jié)果影響也較大，一般沸騰時(shí)間短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少。滴定速度過(guò)快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，測(cè)定時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制上述條件，力求一致。平行試驗(yàn)的樣液消耗量相差不應(yīng)超過(guò)。 思考題：1   在費(fèi)林試劑比色法中為什么可以用亞甲基藍(lán)作為滴定終點(diǎn)的指示劑？2   用費(fèi)林試劑比色法測(cè)定還原糖，