實驗一細(xì)胞的形態(tài)觀察及其大小測量

1、實驗一細(xì)胞的形態(tài)觀察及其大小測量【實驗?zāi)康摹?、通過對原核和直核各種形態(tài)細(xì)胞的光學(xué)顯微錨觀寮，了解細(xì)胞的形態(tài)及其顯微結(jié)構(gòu);2、學(xué)習(xí)顯微測量的方法，對細(xì)胞的大小有一直觀認(rèn)識。【實驗用A】普通光學(xué)顯微鏡;目橫測微尺;鏡臺測微尺;栽玻片;蓋玻片等。【實驗材料】人肝細(xì)胞切片;雞血紅細(xì)胞;秦豆葉片橫切片;洋蔥。【實驗內(nèi)容和方法】 (一)細(xì)胞形態(tài)觀察1、動物細(xì)胞的觀寮(1) 鼠肝細(xì)胞切片：在顯微錯下仔細(xì)觀寮肝細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造。注意肝細(xì)胞之間的界限、 細(xì)胞的形狀、細(xì)胞核的形狀和數(shù)量、核仁的形狀和數(shù)量、細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)構(gòu)造以及細(xì)胞質(zhì)和細(xì) 胞核染色的區(qū)別。(2) 雞血細(xì)胞涂片的觀寮：注意觀寮血細(xì)胞的組成；紅細(xì)胞、白細(xì)

2、胞、血小板的形態(tài) 特點。2、植物細(xì)胞的觀察(1) 取秦豆葉片橫切片的觀察：注意表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)。(2) 洋蔥表皮細(xì)胞的形態(tài)觀察：用懾于撕取洋蔥表皮，滴一滴蒸憎水，蓋上蓋玻片。 在顯微鏡下觀寮的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。(-)細(xì)胞的大小和測It1、測微尺的使用目鏡測微尺是一塊圓形玻片，中心刻有一尺，長5lOmm,分成50100格。每格 的實際長度因不同物鏡的放大率和不同鏡筒長度而異。機(jī)臺測微尺是在一塊栽玻片中央，用 樹膠封固一圓形的測微尺，長Imm或2mm.分成100格或200格，每格的實際長度 O.Olmm(lOpm)。當(dāng)用目鏡測微尺來測量細(xì)胞的大小時，必須先用4臺測微尺核實目錯測 微尺每一格的

3、長度。方法如下：(1) 卸下目錯的上透錯，將目錯測微尺劉度向下裝在目鏡的焦平面上，再旋上目鏡的上透 錯。(2) 將熊臺測微尺刻度向上放在錯臺上夾好，使測微尺分度位于視野中央。調(diào)焦至能看清 鏡臺測微尺的分度。(3) 小心移動鏡臺測微尺和轉(zhuǎn)動目熊測微尺(如目鏡測微尺分度模糊，可轉(zhuǎn)動目錯上透錯 進(jìn)行調(diào)焦)，使兩尺左邊的一宜線重合，然后由左向右找出兩尺另一次重合的直線(如圖所示)。記錄兩條重合線間目鏡測微尺和鏡臺測微尺的格數(shù)。按下式計算目機(jī)測微尺每格等干多少ym：測定目機(jī)測微尺每格實長的圖解上尺：目錯測微尺；下尺：錯臺測微尺錯臺測微尺的格數(shù)目鏡測微尺每格的微米數(shù)=X10目備測微尺的格數(shù)例如，圖中鑲臺測

4、微尺1格=目機(jī)測微尺6格，代入公式得:目機(jī)測微尺每格=l/6x 10um=l66|Lim(5)取下錯臺測微尺，換上需要測量的玻片標(biāo)本，用目鏡測微尺測量標(biāo)本。2、計算：根據(jù)測量結(jié)果計算各種細(xì)胞及細(xì)胞核的體積。a長半徑b短半徑半徑r半徑h 商橢球形：V=4Kab2Z3圓球形：V=4/3jtr3圓柱形：V=Ttr2h【作業(yè)與思考】分別描述你看到的不同血細(xì)胞的形態(tài)，并闡述其功能。繪圖。血細(xì)胞分為哪幾大類？2. 任意選擇你所看到的動物細(xì)胞和植物細(xì)胞各一個，繪圖并進(jìn)行適當(dāng)標(biāo)注，測量其大 小，并比較動植物細(xì)胞大小的差異。3、在不同的放大倍數(shù)下，所測得的細(xì)胞大小一致嗎？你認(rèn)為在哪個放大倍數(shù)下測定得 比較準(zhǔn)確？

5、為什么？實驗二PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合【實驗?zāi)康摹?. 了解細(xì)胞融合的原理和過程；2. 初步掌握利用PEG介導(dǎo)動物細(xì)胞融合的實驗技術(shù)。【實驗原理】細(xì)胞融合，即在自然條件下或利用人工法（生物的、物理的、化學(xué)的），使兩個或兩個 以上的細(xì)胞合并成一個具有雙核或多核細(xì)胞的過程。由于不僅同種細(xì)胞可以融合，種間遠(yuǎn)緣 細(xì)胞也能融合，甚至于動植細(xì)胞也能合二為一，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前較廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生 物學(xué)、遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等各個領(lǐng)域，并且取得顯著的成績。化學(xué)融合方法一般使用聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)細(xì)胞在體外進(jìn)行融合。商品PEG的相對分子 質(zhì)量有200-6000范圍內(nèi)的各種規(guī)格，它們均可用作細(xì)胞融合劑。普遍認(rèn)為PEG

6、分子能改 變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口 處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而便細(xì)胞發(fā)生融合。促進(jìn)細(xì)胞融合 的效力，必須采用較高濃度的PEG溶液，但在高濃度PEG溶液下，細(xì)胞可能因脫水而受 到顯蓍的破壞。因此，選擇合適的PEG分子量，濃度及作用時間是PEG融合技術(shù)的關(guān)鍵。 該方法的優(yōu)點是：操作簡單，容易獲得融合體，融合效果好。細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的一個視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞 （包括巳融合的細(xì)胞）的細(xì)胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示?！緦嶒炗们?. 器材：離心機(jī)、顯微錯、天平、水浴鍋、滴管、5ml離心管

7、、燒杯、蓋玻片、栽玻片。2. 材料：雞血懸液。3. 試劑：1） 0.85%的生理鹽水；2 ） GKN 液：8.0g NaCl , 0.4g KCl, 1.77g Na2HPO4.2H2O , 0.69g NaH2PO4.2H2O, 2.0gW 萄糖，O.Olg 酚紅，溶于 lOOOmL 重蒸水中。3）50% （m/V） PEG （439溫?。喝OgPEG （相對分子質(zhì)量= 4000）放入100ml瓶中，高壓滅菌20min。讓PEG 冷卻至50609,勿讓其凝固。加入50ml預(yù)熱至50°C的GKN液，混勻，直379備用。4）1%詹那斯綠B;5）Hanks 溶液（含 NaCl, KC

8、1, NazHPO, KH2PO4 , MgSOq, CaCb,葡萄糖，酚 紅）Hanks 原液（lOx）NaCl80.0gNagHPCh - 12H2O1.2gKClKH2PO4MgSO4 - 7H2O葡萄糖4.0g0.6g2.0glO.Og1.4g稱取1.4g的CaCb,溶于3050ml的重蒸水中。取lOOOml的燒杯及容量瓶各一個，先 放重蒸水800ml于燒杯中，然后按照上述配方，逐一稱取藥品。必須在前一藥品完全溶解 后，方可放入下一藥品，直到葡萄糖憲全溶解后，再將巳經(jīng)溶解的CaCb溶液加入，最后 加水定容至lOOOmhHanks 液：Hanks原液重蒸水0.5%酚紅100ml896ml

9、4 mlCaCb配好的Hanks液，分裝（500ml/瓶）包扎好貼上標(biāo)簽，經(jīng)過高壓滅菌后，4£保存。6）抗凝劑稱取0.48g檸樣酸，1.32g檸檬酸鈉，1.47g葡萄糖溶于80ml重蒸水中，最后 加水定容至100ml?！緦嶒灢襟E】1雞血紅細(xì)胞懸液的制備：將抗凝劑與雞血按1:31:4的比例稀釋，制成雞血紅細(xì)胞細(xì)胞 懸液，放入49冰箱內(nèi)可保存34天；2. 取雞血1ml,加入4ml0.85%的生理鹽水，lOOOrpm離心3min,棄上清液，重復(fù)上述 操作一次；3. 沉淀用適量（4ml） Hanks溶液重懸浮，lOOOrpm離心3min,棄上清液，用（3ml） Hanks溶液稀釋沉淀，制成1

10、0%左右的細(xì)胞懸液，迅速在顯微錯下觀察細(xì)胞密度；4. 取1ml上述細(xì)胞懸液，加0.5ml 50% PEG溶液，439水浴中進(jìn)行細(xì)胞融合（30min 左右）；5. 緩慢加入Hanks溶液至4ml, 口底顛倒輕輕混勻，終止PEG的作用，使細(xì)胞三三兩兩 地分散開來（鏡檢），室溫靜直約20min;6. 托底輕揺后，取1小滴懸液于栽玻片上，加少量的詹那斯綠B染液，染色5min左右；7. 機(jī)檢，觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象?！緦嶒灲Y(jié)果】1. 繪出巳融合的細(xì)胞形態(tài)圖，描述你所觀寮到的細(xì)胞融合現(xiàn)象。2. 計算細(xì)胞融合率。作業(yè)與思考11. 諳分析Hanks溶液的作用是什么（可以從其成分的角度來回答）?2PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合率

11、受哪些因素影響？3. 你認(rèn)為在進(jìn)行細(xì)胞融合時，要注意哪些問題？實驗三動物骨tt細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備與觀察【實驗?zāi)康摹?1) 學(xué)握動物臂歸細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備技術(shù)(2) 觀奈染色體的數(shù)目以及形態(tài)特征【實驗原理】骨備細(xì)胞具有豐窗的細(xì)胞質(zhì)和商度的分裂能力，因此不必經(jīng)體外培養(yǎng)，也不需要植物血 球凝集素(PHA)的刺激，可以直接觀寮到分裂細(xì)胞。經(jīng)過秋水仙素處理后，分裂的骨飾 細(xì)胞被阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)離心、低滲、固宦、滴片等步驟，便可制作出理想的染色 體標(biāo)本，是研究動物細(xì)胞遺傳學(xué)的好材料。骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備，具有取材容易，方 法簡單易行等優(yōu)點，設(shè)備也筒單，在一般的實驗室都可進(jìn)行?！緦嵞槂x般材料

12、和試劑】1 儀黠：天平、低速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、顯微機(jī)、1ml注射器、解剖盤、解剖剪、刀片、試 管架、lOml離心管、吸管、燒杯、量筒、酒精燈、冰凍栽玻片、玻璃板、吸水紙、擦錯紙、 研缽2. 材料小白鼠或無尾兩棲類奮蛙或蟾蛛3.試劑1) Camoy固宦液(新配制的甲醇：冰酣酸= 3:1);2) 0.1%秋水仙素：稱取lOmg秋水仙素，加入10ml的0.65%生理鹽水(Iml含有 lOOOug, 0.1ml 含有 lOOug秋水仙素)；3) 0.85%生理鹽水；1%檸檬酸鈉溶液；2%檸檬酸鈉溶液；0.4%KCi溶液(0.075M)4) 0.0667mol/L 磷酸緩沖液(pH7.4)A 液：10

13、00ml 含 Na2HPO4 9.465 g 或 NazHPCh - 2H2O ll876g 或NazHPOq 12H2O23.88gB 液：1000ml KH2PO4 9.07g取A液80ml+B液20ml混勻成pH7.4磷酸緩沖液；5) 1:10 Giemsa磷酸鹽緩沖液Giemsa 母液：Giemsa 粉 O.Sg,甘油(AR 級)33ml,甲® (AR 級)33ml先將少S甘油加入研缽中，將Giemsa粉充分研細(xì)，再倒入剰余甘油，并在569溫箱中保 溫211,然后再加入甲醇混勻，儲存在棕色瓶中。【方法與步驟】1骨歸細(xì)胞制備如下表小徵步驟71)秋水仙素注射按4ug/g體直腹腔注

14、射，34h后處死。(2) 取后肢脛骨和股骨，切去兩端。(3) 取骨髓細(xì)胞2%檸樣酸鈉溶液Iml用1ml注射器吸取檸檬酸鈉溶液，通過針頭將溶液注入骨腔，沖出骨翩細(xì)胞a 10ml離 心管中(細(xì)胞沖凈后骨騎腔由粉紅變?yōu)榘咨?；摘掉針頭，用注射器筒輕輕反境吸打，使分 散成單個細(xì)胞。(4) 低滲處理預(yù)熱及低滲水浴溫度：37-C.低滲時間：30miii視細(xì)胞多少加入79nil預(yù)熱的0溶液，在水浴中低滲處理(7ml)。2, 600g 或 ISOOrpm 離心 lOmin。3. 棄上清，沿離心管壁緩慢加入新配制的甲醇:冰醋酸(3:1)固定液5ml, 口底顛 倒輕搖，注意不要沖動細(xì)胞團(tuán)塊。加完后立即口底顛倒混勻

15、，靜賣固定20min重童離心一 次，棄上清，再次加入固定液重復(fù)固定一次，靜直：20min。4固定的細(xì)胞經(jīng)離心后，吸去上戾固定液，視管底的細(xì)胞多寡加入少fi05lml新配 制的固定液，將細(xì)胞團(tuán)塊輕輕吸打成懸液(注意：吹打不要過于用力)。5.在干凈并預(yù)冷的栽玻片上滴12滴細(xì)胞懸液。(注意：滴片時滴管離栽玻片有一定 商度有助干染色體分散)，室溫干燥。6.將玻片細(xì)胞面朝上水平放S,滴加1:10 Giemsa磷酸鹽緩沖液34ml,染色 lOmin。7自來水緩慢沖洗掉染液，干燥廚錨檢?！窘Y(jié)果分析I(1) 樣品的染色體數(shù)目是多少？ 19對常染色體，1對性染色體。共40條(2) 要成功制備染色體標(biāo)本，在操作中應(yīng)注意哪些問題？【實臉提示過去實驗中曾經(jīng)出現(xiàn)的問題(1)染色后發(fā)現(xiàn)沒有骨飼細(xì)胞原因：未能將細(xì)胞從骨®腔中洗出；離心不憧造成細(xì)胞流失；低滲過度造成細(xì)胞破裂, 染色體流失；沖洗不愷等(2)染色體分散不佳而造成無法計數(shù)原因：低滲控制不好造成細(xì)胞體積過小；干燥過度等注意：隨時鏡檢才能確定各步驟是否存在問題低滲與離心等步驟的操作要輕。觀寮細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為：1. 細(xì)胞憲整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上。2. 染色體形態(tài)和分布良好。3