微衛(wèi)星DNA在醫(yī)學(xué)中的作用

1、微衛(wèi)星DNA在醫(yī)學(xué)中的作用    1微衛(wèi)星DNA與遺傳標記的發(fā)展當DNA上的多態(tài)性順序與某一位點(常用在致病位點)連鎖時,我們便可利用其作為一種標記物,進行遺傳缺陷的產(chǎn)前診斷、雜合子攜帶者的鑒定以及親子鑒定、群體研究等。遺傳標記的發(fā)展大致可以分為RFLP、VNTR(主要指小衛(wèi)星DNA)、微衛(wèi)星DNA3個階段。1978年Kan和Dozy第1次發(fā)現(xiàn)限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)并用于鐮刀形細胞貧血癥的診斷。1980年Bostein等預(yù)言有可能利用分布在整個基因組中的RFLP作為連鎖研究的遺傳標記。但RFLP酶切片段在人群中的高頻率雜合子往往較難發(fā)現(xiàn),在基因

2、組中的多態(tài)程度往往也較低,這就限制了其應(yīng)用。小衛(wèi)星DNA是RFLP之后的又一類多態(tài)性遺傳標記。它首先由Wyman和While在篩選人類基因文庫時發(fā)現(xiàn),隨后Bell等又在人胰島素基因上游363bp處發(fā)現(xiàn)一種小衛(wèi)星DNA。它也具有種類多,分布廣,高度多態(tài)等特點,作為一種遺傳標記,它比RFLP更具有應(yīng)用價值。1989年Litt和Weber等兩個研究小組分別用PCR證明一種(CA)/(GT)的二核苷酸串聯(lián)重復(fù)順序具有高度的多態(tài)性4,5;隨后Edwards等又發(fā)現(xiàn)了三核苷酸和四核苷酸串聯(lián)重復(fù)順序的多態(tài)性6,人們稱這種串聯(lián)重復(fù)順序為微衛(wèi)星DNA,從符合遺傳標記的高度多態(tài),雜合性高,突變率低等標準來說,微衛(wèi)

3、星DNA比小衛(wèi)星DNA更優(yōu)越;且在方法上由于微衛(wèi)星DNA長度較短,更適合于PCR擴增。1991年“冷泉港基因組作圖和序列分析會議”提出了對微衛(wèi)星DNA研究的重視和投入。盡管人們首先發(fā)現(xiàn)的是二核苷酸微衛(wèi)星DNA,但現(xiàn)在人們正把目光越來越多地投向三核苷酸微衛(wèi)星DNA和四核苷酸微衛(wèi)星DNA,三核苷酸微衛(wèi)星DNA和四核苷酸微衛(wèi)星DNA也顯示出二核苷酸微衛(wèi)星DNA那樣的多態(tài)性,但更易檢測,且電泳圖譜上沒有二核苷酸微衛(wèi)星DNA常常產(chǎn)生的復(fù)合帶紋原因是DNA雙鏈在變性膠上解開,含(AC)重復(fù)的鏈與含(TG)重復(fù)的鏈移動速率不同。Edwards等研究表明三聯(lián)和四聯(lián)重復(fù)順序比二聯(lián)重復(fù)順序變異性更高且擴增更忠實,

4、且發(fā)現(xiàn)只有三聯(lián)重復(fù)順序可能存在于編碼區(qū),如他們發(fā)現(xiàn)(AGC)重復(fù)順序存在于人雄激素受體基因和果蠅切跡基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)6。目前三聯(lián)與四聯(lián)重復(fù)順序的不穩(wěn)定性與人類疾病的關(guān)系正越來越多地引起人們的注意。2微衛(wèi)量DNA在醫(yī)學(xué)遺傳中的應(yīng)用2.1微衛(wèi)星DNA與基因定位和基因組研究基因定位最早是在實驗動植物中進行的。1911年Wilson利用連鎖分析第一次將色盲基因定位在X染色體上。但是運用連鎖分析定位孟德爾遺傳式疾病的致病基因以及連鎖圖譜的完成需要高效標記的獲得,長期以來由于缺少一種既具高信息量又均勻分布的標記,連鎖圖譜一直是項費力費時的工作。遺傳標記的多態(tài)性信息量(PIC)是指某一家系可以利用某一多態(tài)

5、性位點或單體型作為遺傳標記進行基因連鎖分析的概率,通過PIC可以衡量一個多態(tài)性位點的好壞。一個好的多態(tài)性位點應(yīng)具有的特性是:檢測方法簡單可行;與被檢測的致病位點盡可能近,即緊密連鎖;各等位基因在群體中的頻率盡可能高,即有較高的雜合度,使被測個體在該位點盡可能為雜合子。微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)使基因組的遺傳圖譜工作進入了一個新的階段,并且使疾病基因的定位也更容易。其原理是:對特定染色體上的特定遺傳標記進行PCR擴增,首先將其連鎖到染色體某一區(qū)帶然后依次減小到物理距離,這些標記也可用于YAC物理圖譜以及遺傳圖譜與物理圖譜的相互關(guān)系上。微衛(wèi)星DNA的擴增片段一般在100500bp,在聚丙烯酰胺順序膠

6、上可達到一個堿基的分辨率。用微衛(wèi)星DNA作標記可使人類遺傳性疾病基因的定位能在半年甚至更短的時間內(nèi)就能完成,并且隨著標記的增多,連鎖距離能被減小到幾個厘米。這種進展在其它哺乳動物,如大鼠和小鼠中也得到實現(xiàn)。Murry等用微衛(wèi)星標記構(gòu)建了人的高分辨全基因組圖譜,篩選出500個GATA類的克隆,15個CEPH家族的標記定出了基因型,而且將基因型信息不斷加入遺傳圖中。Wilsondisease(WND)是一種常染色體隱性遺傳病,Bowcock等將疾病相關(guān)基因定位在D13S31與D13S59之間,并且構(gòu)建了一個YAC,長約4.5mb,包括9個高度多態(tài)的微衛(wèi)星標記,D13S31與D13S59也在其中7。

7、到目前為止,微衛(wèi)星DNA在應(yīng)用上最成功的例子要數(shù)人和小鼠基因組高密度連鎖圖譜的完成8。Science1994.9報道:經(jīng)過3個發(fā)掘微衛(wèi)星DNA的團體和110個CEPH合作者的努力,已經(jīng)完成了一個完整的連鎖圖譜,它包括5840個位點(其中970個為單一順序),涵蓋4000個cM;在這些位點中,3617個為微衛(wèi)星標記,427個為基因,平均每0.7個cM就有一個標記。這一成功為物理圖譜的完成做了很好的準備,達到了人類基因組工程的第一個目標。有研究表明,在所有已完成的人群多態(tài)性研究中,Y染色體表現(xiàn)出相當?shù)偷亩鄳B(tài)性,迄今為止發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星位點僅為10個左右,但是Y染色體連鎖的多態(tài)性位點在進化研究中卻有其獨

8、特地位,原因在于其父系遺傳方式和無重組現(xiàn)象9。另外對于微衛(wèi)星DNA的研究也要注意一個問題:即突變頻率有時是不可忽略的;這種突變率在不同標記間是不同的,估計在10-510-3之間,某些標記可能更高一些,這在連鎖不平衡研究和其他非參數(shù)分析中必須考慮到,尤其在等位基因頻率計算中要注意。此外微衛(wèi)星DNA的多樣性在非洲人中是最高的,這與其他遺傳標記正好相反,但是卻支持了非洲起源的假說10。2.2微衛(wèi)星DNA與遺傳性疾病及腫瘤大量實驗表明微衛(wèi)星DNA重復(fù)單位數(shù)目的不穩(wěn)定性與一些人類遺傳性疾病有關(guān),到目前為止已發(fā)現(xiàn)有8種相關(guān)的疾病,屬于CGG/CCG重復(fù)的有:脆性X綜合征、Fraxe綜合征;屬于CAG/CT

9、G重復(fù)的有:重癥肌無力(DM)、X連鎖的脊柱和延髓肌萎縮(X-linkedspinalandbul-barmuscularatrophy)、脊髓與小腦運動失調(diào)-型(Spinocerebellarataxiatype-1,SCA1)、Huntington舞蹈征、齒狀核與蒼白球萎縮征(Dentatorubral-palli-doluysianatrophy)、Machado-Joseph綜合征。在脆性X綜合征中,FMR1gene中的(CGG)順序在正常人中的重復(fù)次數(shù)少于60次,攜帶者60100次,而發(fā)病者則多于100次11。Huntington舞蹈癥的突變基因中(CAG)重復(fù)次數(shù)往往超過35次,A

10、ndrew等證明擴展的(CAG)序列在通過種系的傳遞過程中是不穩(wěn)定的12。而對于MJD,在MJD基因(14q32.1)中的(CAG)重復(fù)次數(shù)在正常人為1237次,而發(fā)病者為6284次,并且發(fā)現(xiàn)男性比女性變異大13。Richard和Southerland稱這種不穩(wěn)定的突變?yōu)閯討B(tài)突變,突變情況和重復(fù)單位數(shù)目有關(guān),且突變體往往具有和前一輩不同的突變頻率。最近發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星DNA與腫瘤的密切關(guān)系更引起了人們的極大興趣。Peltomaki發(fā)現(xiàn)了遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(HNPCC)與微衛(wèi)星DNA的密切關(guān)系。作者一共用了345個微衛(wèi)星標記進行篩查,發(fā)現(xiàn)HNPCC基因與D2S123標記緊密連鎖,并且大多數(shù)HNP

11、CC腫瘤中的D2S123片段電泳泳動速率與正常組織中的片段不同,在D2S123標記兩側(cè)的D2S119、D2S147以及其他染色體上的某些標記片段也有電泳速率的改變,說明各標記片段長度有變化。這種微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)存在于HNPCC腫瘤中,但在散發(fā)性腫瘤中非常少見14。此外Thibodean等在對90例結(jié)直癌研究中也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象,變化程度為從2bp到大片段的缺失或擴增15。因為子宮內(nèi)膜癌常與HN-PCC關(guān)聯(lián),Burks等研究了30例子宮內(nèi)膜癌患者,發(fā)現(xiàn)7例(23%)表現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象,作者認為這種遺傳上的變異可能是此類腫瘤在發(fā)生上的重要特征。Ionov則發(fā)現(xiàn)12%的結(jié)直腸癌在(AT)順

12、序和其他簡單串聯(lián)重復(fù)順序上存在缺失,作者認為這種突變可能反映了結(jié)腸的癌變是由于DNA復(fù)制或修復(fù)的不忠實造成16。近來利用微衛(wèi)星DNA對乳腺-卵巢癌的研究大大增多,研究首先是用許多微衛(wèi)星標記對患者家系進行連鎖分析,將疾病相關(guān)基因定位于17q21,命名為BRCA117,18,現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)最常見的BRCA1突變是第2個外顯子中一個2bp的缺失19。2.3個體識別Southern雜交技術(shù)和大量VNTRs位點的發(fā)現(xiàn)使DNA作圖廣泛應(yīng)用到個體識別上,于是VNTR很快取代了以往的HLA分型?，F(xiàn)在又發(fā)展到應(yīng)用微衛(wèi)星DNA來進行個體識別。其優(yōu)點在于快速、簡便、所需DNA量少,相比較Southern分析,只需要其1

13、/101/100量的DNA,來自粗血溶解物或濾紙上的一點血跡就可以進行分析,這一特點大大適用于法庭分析,因為這種情況下往往不可能得到完整的高分子量DNA。在操作方法上可以使用多重PCR來簡化分析,引物設(shè)計在24bp左右,(GC)含量約為50%,因此所有擴增反應(yīng)都有相近的溶解溫度,可以一次同時進行。Alford等利用9個微衛(wèi)星標記做了50例親子鑒定,準確率達99.73%20。Hammond等用13個不相連鎖的微衛(wèi)星標記對4組人群進行了分析,并且證明可以用在解決實驗室樣品的混淆、骨髓移植、親子鑒定、性襲擊以及各種刑事鑒定中21。有些學(xué)者還利用了微衛(wèi)星DNA對某些古代人的遺跡進行分析,這在考古學(xué)方面顯然是一個新的應(yīng)用,但要避免樣品的混淆和真?zhèn)螁栴}。此外目前應(yīng)用在