抗氧化劑和NFκB對大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響

1、抗氧化劑和NFB對大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響摘要目的：探討NFB在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因誘導(dǎo)表達(dá)中的作用及抗氧化劑對內(nèi)皮細(xì)胞iNOS誘導(dǎo)表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法：Griess法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO-水平以反映NO的生成，Northern印跡分析iNOS mRNA水平，EMSA法測定細(xì)胞核內(nèi)NFB的結(jié)合活性。結(jié)果：抗氧化劑可阻斷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系LPS和TNF誘導(dǎo)的NO生成及iNOS mRNA的表達(dá)；LPS和TNF可誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFB的激活并可被抗氧化劑阻斷。結(jié)論：LPS和TNF 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因表達(dá)依賴于NFB的激活；抗氧化劑可通過抑制NFB的活化而

2、阻斷iNOS基因的誘導(dǎo)表達(dá)。主題詞一氧化氮；抗氧化藥；內(nèi)皮中分類號文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000-4718(2000)01-0020-04 Effect of antioxidant and NFB on the induction of iNOS gene in rat pulmonary microvascular endothelial cells in vitroLIU Qing-hang, JIN Hui-ming, WU Zhao-hui, CHEN Yu, LIU Kai(Department of Pathophysiology, Shanghai Medical Univers

3、ity, Shanghai 200032, China)Abstract AIM:To investigate the role of nuclear factor B (NFB) in the induction of iNOS gene by TNF and LPS in endothelial cells and the effect of antioxidant on the induction of iNOS. METHODS:Nitrite was determined based on Griess reaction. iNOS mRNA was analyzed using N

4、orthern blot. NFB in the cell nucleole was detected with electrophoretic mobility shift assay.RESULTS:(1)NO production and iNOS mRNA expression induced by LPS and TNF was blocked by pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC) or N-acetylcysteine(NAC). (2)LPS and TNF triggered the activation and translocation

5、of NFB, and PDTC or NAC inhibited the activation of NFB induced by LPS and TNF.CONCLUSIONS:(1)The induction of iNOS gene by TNF and LPS is dependent on the activation of NFB.(2)Antioxidants may inhibit the induction of iNOS gene through the inhibition of NFB activation.MeSHNitric Oxide; Antioxidants

6、; Endothelium內(nèi)皮細(xì)胞在多種細(xì)胞因子或內(nèi)毒素作用下表現(xiàn)出一些新的特性，如細(xì)胞表面粘附分子及主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)抗原的表達(dá)，產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達(dá)，使內(nèi)皮參與活躍的免疫反應(yīng)，此過程稱為內(nèi)皮細(xì)胞的激活1。內(nèi)皮細(xì)胞的過度激活將導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)一系列表型變化并產(chǎn)生如動脈粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。其中內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的過度表達(dá)所致的內(nèi)皮細(xì)胞低反應(yīng)性及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在炎癥、免疫性疾病及內(nèi)毒素休克的發(fā)病過程中具有重要意

7、義。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞激活時iNOS表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。iNOS基因的啟動子區(qū)域含有多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點包括NFB、AP-1、NF-IL6，Oct-1等2，而核因子B(nuclear factor B, NFB)被認(rèn)為在多種參與炎癥反應(yīng)的蛋白質(zhì)因子的基因調(diào)控中擔(dān)任重要角色，因而可能是內(nèi)皮細(xì)胞激活的調(diào)控中一個重要轉(zhuǎn)錄激活因子2，3。據(jù)報道巨噬細(xì)胞，腎系膜細(xì)胞中iNOS的表達(dá)依賴于NFB的活化，但NFB與內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)系報道較少。本文探討NFB在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因誘導(dǎo)表達(dá)中的使用。另外，抗氧化劑被認(rèn)為是NF活化的有效抑制劑，因而，本文亦研究抗氧化劑對于LP

8、S和TNF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響及其機(jī)制。材料和方法一、材料：重組人腫瘤壞死因子-(recombined human tumor necrosis factor-， TNF-)，大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)，N-acetylcysteine(NAC)購自Sigma公司，無酚紅DMEM培養(yǎng)基，小牛血清購自Gibco公司，Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit , Dig Gel Shift Kit購自Boehrin

9、ger Manhaim公司。二、方法：(一)細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照我們以往報道的方法4。選用體重100 g左右的雄性SD大鼠，烏拉坦腹腔注射麻醉，腹腔內(nèi)注射肝素(1000 U/100 g BW)，左心室切口，從右心室緩慢灌注10 mL D-Hanks液至肺葉顏色變白。小心剪取邊緣肺組織，進(jìn)而剪切成1 mm1 mm1mm小塊，按12塊/cm密度接種于培養(yǎng)瓶，用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6070 h后去除組織塊，換液，直至長成致密單層。此細(xì)胞已應(yīng)用抗vWF抗體及內(nèi)皮細(xì)胞抗體CD31進(jìn)行免疫組化鑒定并應(yīng)用相差顯微鏡和電鏡進(jìn)行形態(tài)鑒定，非內(nèi)皮細(xì)胞少于5%4。使用傳代至2

10、3代的細(xì)胞，細(xì)胞在加入藥物處理前12 h所用培養(yǎng)液血清濃度降為0.5%。進(jìn)行NO?水平測定用的細(xì)胞培養(yǎng)體系使用無酚紅DMEM培養(yǎng)基。(二)NO水平的測定：根據(jù)Griess反應(yīng)原理，用我室改良的方法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO?水平以反映NO的生成4。培養(yǎng)上清液經(jīng)離心后取100 L加入等量的Griess反應(yīng)液1%磺胺；0.1% N-1-萘乙二胺(溶劑為5%磷酸)混勻，室溫放置10 min，應(yīng)用酶標(biāo)比色儀Biorad 450于540 nm處進(jìn)行光密度測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為NO-濃度。(三)探針的制備與標(biāo)記：應(yīng)用RT-PCR方法制備用于Northern雜交的探針5。所用的引物序列為：(1)GAPDH：

11、5-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3；5-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3；(2)iNOS:5-GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG-3；5-CTC CTG CCC ACT GAG TTC GTC-3。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)低溶點瓊脂糖凝膠分離并純化用以制備探針。探針的標(biāo)記應(yīng)用“Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit ”試劑盒，按說明書進(jìn)行地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記并檢測標(biāo)記效率。(四)Northern印跡分析：細(xì)胞總RNA抽提采用文獻(xiàn)報道的一步法，1%瓊脂糖-甲醛變性膠

12、電泳，毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移至尼龍膜，預(yù)雜交3 h，雜交過夜，洗膜。應(yīng)用“Dig High Prime DNA Labeling and Detection Start Kit ”試劑盒檢測，至觀察到藍(lán)紫色條帶后即終止反應(yīng)。條帶經(jīng)光密度掃描，將比值(iNOS mRNA/GAPDH mRNA)進(jìn)行統(tǒng)計分析。(五)EMSA(electrophoretic mobility shift assay)：核蛋白的提取參照Singh等的方法6。核蛋白質(zhì)定量采用考馬斯亮蘭G-250染色法。NF結(jié)果一、抗氧化劑可阻斷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系NO的誘導(dǎo)生成：大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)

13、作用24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO?水平顯著高于對照組(P0.01， n=5)。提示LPS及TNF可誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成。而在培養(yǎng)體系預(yù)先加入抗氧化劑PDTC(0.1 mmol/L)或NAC(20 mmol/L)1.5 h則可顯著抑制LPS及TNF誘導(dǎo)的NO的生成(P0.01，n=5)(1A)。另外，抗氧化劑PDTC及NAC對內(nèi)皮細(xì)胞NO誘生的抑制作用呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(1B，C)。 Fig 1Accumulation of nitrite in rat pulmonary microvascular endothelial cells(RPMECs) culture mediu

14、m(A)RPMECs were treated with LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL) for 24 h, or preincubated for 1.5 h with PDTC (0.1 mmol/L) or NAC (20 mmol/L) then for the next 24 h with LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/mL).(B)RPMECs were preincubated with various concentrations of PDTC for 1.5 h and for the next 24 h with LPS (1 g/mL

15、)+TNF(100 U/mL).(C)RPMECs were preincubated with various concentrations of PDTC for 1.5 h and for the next 24 h with LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/mL)1大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO?水平的變化二、LPS和TNF可誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFB的激活：應(yīng)用LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)處理大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞2 h，即可觀察到較明顯的NFB結(jié)合活性；而應(yīng)用PDTC(0.1 mmol/L)或NAC(20 mmol/L)預(yù)處理1.5 h后則N

16、FB的結(jié)合活性被顯著抑制(P0.05，n=3)(2)。提示抗氧化劑可以抑制LPS及TNF對內(nèi)皮細(xì)胞NFB的激活及核內(nèi)轉(zhuǎn)位。Fig 2EMSA of NFB in RPMECs(1)Control (2) LPS(1 g/mL)+TNF(100 U/mL)(3)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+PDTC(0.1 mmol/L)(4)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+NAC(20 mmol/L)2大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFB結(jié)合活性的EMSA分析(在相同實驗條件下重復(fù)3次，得到類似結(jié)果)三、抗氧化劑可阻斷大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)：Nor

17、thern Blot分析表明未經(jīng)刺激的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA水平不能檢出，而加入LPS(1 g/mL)和TNF(100 U/mL)處理2 h，則觀察到iNOS mRNA明顯的誘導(dǎo)表達(dá)(光密度值升至0.3750.086，與對照組比P0.05，n=3)。預(yù)先應(yīng)用抗氧化劑PDTC或NAC處理1.5 h則可顯著抑制TNF及LPS誘導(dǎo)的iNOS mRNA表達(dá)水平(光密度值分別降至0.0180.011及0.0260.019，與TNF+LPS組比P0.05，n=3)，而GAPDH mRNA的表達(dá)水平則不受PDTC及NAC的影響(P0.05，n=3)(3)。Fig 3(A)RT-PCR amp

18、lification of iNOS and GAPDH mRNA in RPMECs1.LPS (1 g/mL)+TNF (100 U/mL)2.RPMECs(Control)3.4.GAPDH(B)Northern Blot analysis of iNOS mRNA using cDNA probes(1)Control (2) LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL) (3)LPS(1 g/mL)+TNF (100 U/mL)+PDTC(0.1 mmol/L) (4)LPS (1 g/mL)+TNF(100 U/mL)+NAC(20 mmol/L)3(A)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)

19、胞iNOS及GAPDH mRNA的RT-PCR擴(kuò)增(B)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的Northern Blot分析(在相同實驗條件下重復(fù)3次，得到類似結(jié)果)討論內(nèi)皮細(xì)胞的激活往往表現(xiàn)為一系列特定基因的表達(dá)。目前的研究表明，這些基因結(jié)構(gòu)存在一個共同點，即其5端啟動子區(qū)域的NFB的結(jié)合位點，其中iNOS基因亦具有NFB的調(diào)控作用位點。本文發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素及TNF可激活微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFB并使之向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，而應(yīng)用抗氧化劑PDTC或NAC則可抑制NFB的激活并同時抑制細(xì)胞因子及內(nèi)毒素誘導(dǎo)的iNOS mRNA水平及NO的生成。為排除抗氧化劑對基因表達(dá)的非特異性作用，我們觀察到PDTC或NAC對GAPDH

20、的組成型表達(dá)并無明顯影響，且GAPDH基因的5調(diào)控區(qū)并無NFB的結(jié)合位點，這表明抗氧化劑主要是通過影響內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，即抑制NFB的活化而起作用的；并且提示內(nèi)皮細(xì)胞iNOS基因的誘導(dǎo)表達(dá)依賴于NFB的激活。NFB作為一種轉(zhuǎn)錄活化因子，通常以NFB/Rel轉(zhuǎn)錄因子家族的異源二聚體的形式與DNA相結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，其中的NFB1(P50)和RelA(P65)亞單位二聚體為常見。NFB在靜息的內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中與其抑制蛋白(inhibitor of NFB， IB)相結(jié)合。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞激活時IB被磷酸化進(jìn)而降解使之與NFB二聚體解離，于是活化的P65-P50二聚體迅速由

21、胞漿轉(zhuǎn)位至胞核，與DNA的靶向序列相結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄?？寡趸瘎┛梢砸种芅FB的活化過程，提示活性氧可能是NFB活化的重要介質(zhì)。NFB可以作為一個重要的靶分子應(yīng)用于伴有內(nèi)皮細(xì)胞過度激活的病理過程如炎癥，動脈粥樣硬化，敗血癥等。雖然糖皮質(zhì)激素作為一種常用的抗炎藥物，可以抑制NFB的激活及細(xì)胞促炎分子的表達(dá)9，但糖皮質(zhì)激素的副作用影響了它們的長期使用。抗氧化劑作為一種小分子化學(xué)物質(zhì)通過抑制NFB的活化過程而阻斷細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子3、iNOS等分子的基因表達(dá)，因而抗氧化劑可能成為此類疾病的治療中具有應(yīng)用前景的一類藥物。劉清行（上海醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，上海 200032）金惠銘（上海醫(yī)科大學(xué)病理生

22、理教研室，上海 200032）吳朝輝（上海醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，上海 200032）陳愉（上海醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，上海 200032）劉凱（上海醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，上海 200032）參考文獻(xiàn)1Asasa S, Ono S, Seki S, et al. Inhibitory effect of protease inhibitor on endothelial cell activation J. J Surg Res, 1998, 80(2):182190.2Lowenstein CJ, Alley EW, Raval P, et al. Macrophage nitric ox

23、ide synthase gene:two upstream regions mediate induction by interferon and lipopolysaccharide J. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:97309734.3Ferran C, Millan MT, Csicmadia Vilmos, et al. Inhibition of NFB by pyrolidine dithiocarbamate blocks endothelial cell activation J. Biochem Biophys Res Commun, 1995, 214(1):212223.4劉清行，金惠銘. TNF對大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生及NOS mRNA表達(dá)的影響J.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999，26(1)：47.5Lee CC, Wu X, Gibbs RA, et al. Generation of cDNA probes directed by amino acid sequence cloning of uratic oxidase J. Science, 1988, 239:12881291.6Singh S, Aggarwal BB.