原位雜交組織化學(xué)的方法和常用試劑配制

1、原位雜交組織化學(xué)的方法和常用試劑配制一、雜交前準(zhǔn)備（一）DEPC水是經(jīng)DEPC處理過的滅菌蒸餾水。DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNA酶的強(qiáng)抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中，所有液體試劑都應(yīng)經(jīng)DEPC處理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待處理水（蒸餾水等）中，經(jīng)猛烈振搖后，于室溫靜止數(shù)小時(shí)，然后高壓滅菌，以除去降解DEPC（DEPC分解為CO2和乙醇）。有些試劑可直接加入DEPC，終濃度一般為0.1%0.4%，原則上在雜交及其以前的步驟中，所有液體試劑均需用DEPC處理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀釋。此外，接觸

2、標(biāo)本以及標(biāo)本有關(guān)的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。注意：DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進(jìn)行，并避免接觸皮膚。含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。（二）載玻片的處理組織原位雜交，常在載玻片上進(jìn)行，故載玻片的洗滌至關(guān)重要，必須保持清潔，并且不能有任何核酸的污染。處理方法如下：（1）先經(jīng)洗衣粉浸泡過夜，次日自來水沖洗后，泡酸數(shù)小時(shí)以上，取出后再用流水沖洗，雙蒸水沖洗23次，置160以上烤箱中燒烤4h以上，或經(jīng)15磅高壓滅菌20min。經(jīng)以上處理可清除載片上的核酸酶。（2）HCl處理法試劑: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇步驟: a. 玻片在室溫下于1M

3、 HCL中浸泡30分鐘     b. DEPC水中洗片     c. 95%乙醇中洗片     d. 空氣中干燥    e. 重復(fù)一遍 ad.    f. 鋁箔包好備用.（三）硅化【方法】（1）將一扎新的蓋玻片散開，在通風(fēng)條件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷卻后,倒掉鹽酸。（2）用去離子水沉漂洗玻片，豎放在架子上自然干燥。（3）硅化蓋玻片：通風(fēng)條件下，將單塊的蓋玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilan

4、e,DMDC）液中浸幾下，豎入在架子上干燥。（4）收集干燥的蓋玻片于一可耐熱的petri氏盤（或培養(yǎng)皿）中，用去離子水漂洗數(shù)次，徹底清洗。（5）用鋁箔將裝有蓋玻片的培養(yǎng)皿包好，于180烘烤4h過夜。取出待冷至室溫后，即可進(jìn)行后續(xù)處理。附：2%DMDCDMDC  2ml    三氯乙烷 98ml配制：按比例兩者充分混勻，靜止待氣泡消失即可使用。用途：硅化玻片（載片、蓋片均可）?！痉椒?】將經(jīng)過洗凈的玻璃蓋片分散開放在一金屬網(wǎng)中，并將該網(wǎng)放入一接有真空泵的干燥器中。同時(shí)，在干燥器中放一盛有約1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）

5、的小燒杯。蓋好干燥器（確保密閉），抽真空約5min，然后讓空氣沖入。取出盛有蓋片的金屬網(wǎng)架，用錫箔紙包埋，于250以上烘烤4h以上，最好過夜。冷卻后備用。本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60燒干?！痉椒?】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法   試劑: 2%的APES/丙酮(V/V,  丙酮,  DEPC水   步驟: 1. 玻片先于室溫中在APES液中浸泡10秒2. 丙酮中洗滌3.DEPC水中漂洗4.空氣中干燥5.4度保存(最好用鋁箔包好,避免污染儀器專場(chǎng)展示：化學(xué)試劑  標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

6、生化試劑常用試劑試劑配制原位雜交組織化學(xué)【方法4】（1）49ml氯仿與1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；（2）倒入每個(gè)擬硅化的試管或離心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水沖洗；（3）玻璃器皿使用前位于180以上烘烤2h以上，塑料器皿應(yīng)于60烘烤過夜。注意：DMDC有毒且高度揮發(fā)，應(yīng)于通風(fēng)環(huán)境操作并戴口罩、手套，避免接觸皮膚或吸入。（四）載片的包被（粘貼）沾附劑（1）多聚賴氨酸(poly-L-Lycine,PLL儲(chǔ)備液（05%）: PLL 25mg,  DEPC水 5ml 按上述劑量充分混合，即為濃度為5mg/ml(0.5%的PLL液。常分裝成1ml的包裝，-20存放。該液

7、為儲(chǔ)備液，可反復(fù)凍融，無明顯影響。用前充分混合。工作液（0.01%）：0.5% PPL, DEPC水 50ml充分混合，靜止待氣泡消失。（2）明膠液配方: 明膠 2.4g, 甲明礬 2.4g, DEPC水 1000ml配法：先稱取明膠溶于500800ml DEPC水中，加熱攪拌助溶，待明膠完全溶解以后，加入甲明礬溶解后即可使用。注意，包被玻片時(shí)，明膠液溫度最好保持在60左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。2多聚賴氨酸包被玻片的制備方法（其它包被劑相同）（1）將事先準(zhǔn)備好的經(jīng)160以上烘烤，并冷卻至室溫的玻片（載片或蓋片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸幾下，分散開豎放在架

8、子上，于空氣中自然干燥，4備用。注意：浸蘸時(shí)，務(wù)必使整個(gè)玻片完全浸于液體中，否則，包被不完全會(huì)產(chǎn)生標(biāo)本脫落現(xiàn)象；干燥過程中注意避免塵埃污染；按上法處理的玻片通?？纱娣旁谝欢〞r(shí)間（室溫1月以上，4更長(zhǎng)），但仍建議盡早使用。（2）多聚賴氨酸1mg溶于10ml滅菌的去離子水或1mmol/L的Tris-HCl緩沖液中（pH7.0），將其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。該法包被的玻片可用于細(xì)胞涂片和切片。（3）將PLL工作液滴至蓋玻片上5l/片，用另一蓋玻片以推血涂片方法推片，或用另一蓋玻片緊貼于其上，相互磨擦以使兩蓋玻片相對(duì)的一面涂布上PLL。該法制備的玻片，只有一面是包被有PLL，故制備時(shí)，待其晾干

9、后，應(yīng)作好記號(hào)，然后保存后備用。多聚賴氨酸可用于多種核酸雜交，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，有許多其它方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。配制好的液體可存放于4或室溫，但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)解聚而失效，故建議使用時(shí)盡量新鮮配制。（4）Vectabond粘附劑該試劑是Vector公司新近推出的一種新型粘附劑。它與其它粘附劑的主要區(qū)別是：一般的粘附劑是通過物理性覆蓋在玻片表面，天長(zhǎng)日久，可能由于包被不完全或局部脫落而致切片等標(biāo)本易于脫落。而Vectabond試劑是通過化學(xué)性作用，改變玻璃表面的分子結(jié)構(gòu)，使標(biāo)本貼附牢固，不易脫落，且保持時(shí)間長(zhǎng)久，耗量小，價(jià)格便宜，一個(gè)包裝7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：標(biāo)本（鋪片、切片等）

10、丙酮（5min）Vectabond試劑工作液（5min）dH2O(2×5min干燥（溫箱，數(shù)小時(shí)過夜）用鋁箔包好，室溫備用。注意：制備和保存過程中避免污染。經(jīng)上述處理的載玻片一般可存放半年以上（4可更長(zhǎng)）。（五）硅魚精子DNA的制備（1）在50ml滅菌聚乙烯管中加入1g鮭精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室溫放置，DNA形成白色沉淀，充分振搖至沉淀物相互纏繞在一起，用吸頭尖端使之形成一球團(tuán)狀（23min）；（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。搖動(dòng)小管使DNA懸浮、溶解，將小管置5015min助溶；（4）用D

11、EPC水將混合物稀釋至175ml（總體積），充分混合，注意確保管內(nèi)已無顆粒狀；（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.4）；（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH為7.07.5；（7）用無菌微孔濾膜過濾液體，去除顆粒。260nm測(cè)定溶液的OD值，方法是：取20l DNA液混合于980l水中，混勻后測(cè)定，吸收值乘以50即為DNA濃度（g/ml）；（8）制備好的DNA液儲(chǔ)于-20備用，用前取出凍融后煮沸。二、關(guān)于探針的標(biāo)記（一）cRNA探針的同位素標(biāo)記1 標(biāo)記液（轉(zhuǎn)錄標(biāo)記）5X轉(zhuǎn)錄緩沖液       

12、60;                      2ulDDT(400mmol/L                             1ul線性化DNA探針(模板 (1ug/ul         

13、;       1ug32P-CTP(12.5umol/L-50uCi                  5ulRNA多聚酶(20u/ul                     1ul2 轉(zhuǎn)錄緩沖液Tris-HCl(pH7.5  200mmol/L,  Mg

14、Cl2   30mmol/L, 精瞇 10mmol/L,DTT  50mmol/L, BSA(不含RNA酶  0.5mg/ml, HPRI 5000u/ml,ATP,GTP,UTP各 2.5mmol/L,   CTP*：用地高辛或生物素標(biāo)記時(shí)，用UTP替代。3 標(biāo)記終止液無RNA酶的DNA酶 1ul,  tRNA(10mg/ml  1ul,  滅菌去離子水 188ul4標(biāo)記探針?biāo)庖?.4mmol/L 碳酸氫鈉  20ul, 0.6mm

15、ol/L 碳酸鈉 20ul, 滅菌去離子水 160ul.  先用dH2O懸浮探針，再加入后兩種試劑，輕輕振搖混合，于60條件下反應(yīng)。5探針?biāo)鈺r(shí)間注：LO探針初始長(zhǎng)度（kb）Lf探針的終長(zhǎng)度（kb）K0.11kb/min6探針?biāo)饨K止液    3mmol/L醋酸鈉  6.6ul, 醋酸 1.3ul每次加入充分混合，臨用前配。7探針沉淀液   7mmol/L醋酸胺 100ul,  純酒精  750ul, rRNA(10mg/ml 2ul每次加入，充分混合，新鮮配制。（二）寡聚核

16、苷酸3端標(biāo)記（cRNA探針）1 標(biāo)記反應(yīng)液寡核苷酸 20ng, 5X轉(zhuǎn)錄緩沖液  4ul, 32P-dATP(3000Ci/mmol/L 7ul,CoCl2  2ul,   末端轉(zhuǎn)移酶   1ul, 滅菌去離子水  20ul.2終止液：0.2mol/L EDTA3.探針沉淀液    tRNA   1ul, 7mmol/L 醋酸胺  100ul, 純乙醇  750ul（三）cRNA探針非同位素標(biāo)記（地高辛及生物素）1

17、標(biāo)記液5X轉(zhuǎn)錄緩沖液  2ul, 0.2mmol/L DTT 1ul, 模板DNA(1ug/ul 1ul,Dig-11-UTP(10mmol/L *   1ul,  32PCTP# 1ul,  RNA 聚合酶(20u/ul1ul,   無菌去離子水  3ul*：生物素標(biāo)記時(shí)為10mmol/L的生物素-11-UTP#：為檢測(cè)標(biāo)記率而加。2轉(zhuǎn)錄標(biāo)記終止液（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛標(biāo)記法（2）生物素標(biāo)記終止液：   無RNA酶的DNA酶(1u/

18、ul 1ul,  tRNA(10mg/ml  2ul,  HPRI 1ul,滅菌去離子水 186ul（四）DNA探針標(biāo)記常用試劑的配制（1）10 ×缺口平移緩沖液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/L-巰基乙醇、1mg/ml BSA。（2）缺口平移反應(yīng)終止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。（3）DNase:干粉狀DNase(20003000u/mg溶于20mmol/l

19、 Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10l分裝，-20保存一年。（4）10×DNA聚合酶（Klenow片段）緩沖液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。（5）10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亞精胺。（6）10×隨機(jī)引物標(biāo)記緩沖液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L -巰基乙醇；500g

20、/ml BSA。（7）1×加尾緩沖液：100mmol/L二甲胂化鉀，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。（8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0:EDTA 52.02g溶于400ml水中，調(diào)pH至8.0，加水至500ml，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。（10）4mol/L醋酸鈉：取無水醋酸鈉82g溶于200ml水中，用醋酸調(diào)pH至6.5，加水至250ml，高壓滅菌，或0.45m膜過濾，室溫保存。（11）10% SDS：10g SD

21、S（十二烷基硫酸鈉）溶于50ml水中，加水至100ml，分裝后室溫保存。（12）20×SSC：取NaCl 175.3g;檸檬酸鈉88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH調(diào)pH至7.0；高壓滅菌，室溫保存。（13）無菌水：100ml去離子水或雙蒸水，分裝，高壓滅菌，室溫保存，開瓶后僅限一周使用。（14）10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10mmol/L亞精胺（非必需）。（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/l，保存在甘油中，-20。（16）TE緩沖液（Tris/EDTA

22、）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L貯存液，1.0mmol/l EDTA,pH8.0(20l 0.5mol/L貯存液，加水至100ml，室溫保存。（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加濃HCl 75ml ,邊加邊緩慢攪動(dòng)，至pH7.4,于加水至1000ml。（18）1mol/L DTT(二硫蘇糖醇：3.0g DTT溶于20ml水中，分裝，于-20貯存。（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）：在燒杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTANa2·2H2O,充分混勻，加10mol/

23、l NaOH調(diào)pH至8.0,加水至500ml。（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混勻，再加水至500ml。（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。（22）1mol/L HCl：加86.2ml濃鹽酸至913.8ml水中。（23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高壓滅菌,室溫保存。三、固定劑進(jìn)行原位雜交的組織或細(xì)胞標(biāo)本常需經(jīng)固定處理。盡管許多化學(xué)物質(zhì)對(duì)組織/細(xì)胞有固定作用，但核酸原位雜交的理想固定液應(yīng)具備如下特點(diǎn)：能很好地保持組織細(xì)胞的狀態(tài)；對(duì)核酸無抽提、修飾及降解作用；不改

24、變被檢核酸分子在組織細(xì)胞內(nèi)的定位；對(duì)核酸及探針的雜交過程無阻礙作用；固定液本身對(duì)雜交信號(hào)無遮蔽、掩蓋作用，如不使本底增加等；理化性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉。1 4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）PFA 40g,  DEPC水 500ml, 2XPBS 500ml 配法：稱取40g PFA溶于裝有500ml DEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續(xù)加熱磁力攪拌至6065，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮狀（滴加），再加入約500ml 2×PBS，充分混勻（在冰浴或冷水浴中），可再檢測(cè)一下pH，過濾后定容至1000ml，

25、室溫或4保存?zhèn)溆?。注意：配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對(duì)粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；加熱時(shí)，溫度不宜過高，常為6065，否則，PFA降解失效；配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間，但過久的液體，固定效果下降，建議盡早使用。配法：按上述比例稱取試劑，溶于DEPC水（也可用蒸餾水加DEPC）500800ml中，過濾后，加水定容至1000ml，高壓滅菌。通常配制成10×PBS的儲(chǔ)備液，2×PBS和1×PBS可用DEPC水稀釋獲得。除用DEPC水配制PFA外，也有用滅菌蒸餾水或經(jīng)DEPC處理的0.010.1

26、mol/L的PBS配制的，方法及注意事項(xiàng)同上。4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，同時(shí)對(duì)形態(tài)保持也較好。通常組織塊固定412h，載片固定時(shí)間在1015min以內(nèi)，RNA含量較為恒定。過度延長(zhǎng)固定時(shí)間會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。2甲醛10%甲醛（Formaldehyde,FA）量取市售甲醛(約40%10ml和DEPC水90ml充分混合而可。較適于檢測(cè)RNA的組織及細(xì)胞固定，也可用于新鮮冰片切片后固定。10%福爾馬林試劑：較適于固定細(xì)胞。10%中性福爾馬林市售甲醛100mlNa2HPO44gNaH2PO4

27、6.5gDEPC水1000ml常用于石蠟樣品切片的固定。10%的甲醛由于有促進(jìn)DNA雙鏈分子交聯(lián)的作用，干擾DNA變性，故不適于DNA雜交。在組織或細(xì)胞原位雜交中，可通過使用含50%甲酰胺的雜交液使DNA變性解鏈而解決。這類固定液在DNA/RNA雜交中有較好的效果。34%戊二醛效果較40%差。40.1%戊二醛常用于固定組織，適于新鮮組織冰凍切片及石蠟切片的后固定，常用于檢測(cè)DNA的原位組織雜交方法。5乙醇/醋酸（或冰醋酸）將乙醇與醋酸按3：1的體積比充分混合即可。該液較適于固定細(xì)胞的原位雜交，尤其檢測(cè)DNA時(shí)。乙醇/醋酸雖廣泛應(yīng)用于原位雜交中，但RNA保留較差，可本底很低，即背景染色淡。6甲醇

28、/醋酸（3：1）用前按體積比3：1比例充分混合即可。7甲醇/丙酮（1：1）適于培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交技術(shù)。84%多聚甲醇-0.5%1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸緩沖液中，用于免疫電鏡樣品固定。四、LB培養(yǎng)基（一）液體LB培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基）配制：取一1000ml的燒杯，將事先稱取好的試劑加入杯內(nèi)，加H2O約500800ml攪拌使其溶解完全。用5N的NaOH調(diào)pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高壓滅20min。（二）瓊脂糖平板培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂（或瓊脂糖）15g液體培養(yǎng)基（如LB）1000ml按濃度比例，將瓊脂加入液體培養(yǎng)基（如LB）中，稍加攪拌，用紗布或紙封

29、好瓶口，15磅高壓滅菌20min。五、小量質(zhì)粒提取主要液體(見試劑盒六、雜交前處理1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于雜交前標(biāo)本處理，其作用是使組織達(dá)到一定消化，利于檢測(cè)分子的穿透，從而提高檢測(cè)方法的敏感性，但各種組織在不同條件下消化程度不一，因此，具體應(yīng)用時(shí)，應(yīng)根據(jù)組織種類、溫度確定反應(yīng)時(shí)間及酶的濃度。過度消化可使組織形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞，核酸分子也會(huì)受到影響。通常是將其配成儲(chǔ)備液（1mg/ml），臨用前，再配成工作液（約0.025mg/ml）。配制方法：精心稱藥，將二者充分混合后，分裝成小份，-20存放，用時(shí)再取出凍融，余者棄去。（2）工作液（臨用前配）：取

30、儲(chǔ)備液（1mg/ml）按1：40稀釋，充分混合，即得約含Pro.K為25mg/ml的工作液。稱取上述試劑，充分混合即可。1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0：0.5mol/L的EDTA：2甘氨酸（1）1mol/L甘氨酸：（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：30.25%醋酸-0.25%醋酸酐配制：按上述配方，先以少許DEPC水溶解NaCl 5g，然后加入三乙醇胺13.2ml及濃HCl 4ml。DEPC水定容至約1000ml(997.5ml，臨用前，一邊搖動(dòng)溶液一邊加入醋酸酐2.5ml，充分混合。注意操作時(shí)避免濃HCl 濺出，最好在通風(fēng)條件下進(jìn)行。生物體內(nèi)有些組織，如神經(jīng)組織中的蛋白質(zhì)，對(duì)帶負(fù)電荷的核酸探針較易吸附。經(jīng)該液乙?；幚砗螅墒骨衅瑯?biāo)本表現(xiàn)帶上負(fù)電荷，有排斥帶負(fù)電的核酸探針，減少非特異吸附，降低反應(yīng)背景的作用。4RNA酶 A溶液取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分裝成小份（1ml,10mg/ml），-20儲(chǔ)存。臨用前，取RNA酶A