吡啶誘導(dǎo)白毛真菌三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素的調(diào)節(jié)E.P

1、 吡啶誘導(dǎo)白毛真菌三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素的調(diào)節(jié)微生物研究所，俄羅斯科學(xué)學(xué)會(huì)，pr.60-letlya Oktyabrya 7,k,2,Moscow,117811 Russia,1994年10月8號(hào)摘要：吡啶誘導(dǎo)刺激三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素。6-甲基-2氨基吡啶被證明是最有效的刺激劑。利用放線菌和放線素是基因調(diào)節(jié)從頭合成的刺激反應(yīng)器。6-甲基-2氨基吡啶在三孢布拉氏霉菌合成類胡蘿卜素中的作用是抑制環(huán)化酶和一些脫氫酶，刺激類胡蘿卜素前體和一種抗氧化劑的合成。6-甲基-3-乙基-3-羥基吡啶是一種抗氧化劑，在加入6-甲基-2氨基吡啶的條件下，產(chǎn)生一種作用刺激生物合成番茄紅素。提出了三孢

2、布拉氏菌合成番茄紅素中可能的生物作用。 在現(xiàn)代生物工藝學(xué)中，被稱為化學(xué)生物調(diào)節(jié)器的特殊復(fù)合物的利用是獲得次生代謝物的一種有效方法，例如：-紫羅酮，三孢酸和VA通過白毛真菌三孢布拉氏菌增加-胡蘿卜素產(chǎn)量10-15倍。 前幾年，另一種類胡蘿卜素番茄紅素，由于它好的抗氧化作用，在生物工藝學(xué)和藥學(xué)中吸引了特殊的關(guān)注。它還被用做天然染料，把食品染色成紅色和桃紅色。番茄紅素的化學(xué)合成與微生物合成相比，在經(jīng)濟(jì)上較差，工業(yè)復(fù)合過程較好。三烴基銨氯化物和吡啶這些生物調(diào)節(jié)劑在植物、真菌和細(xì)胞中的使用抑制胡蘿卜素的生物合成，增強(qiáng)了番茄紅素的產(chǎn)率。相似研究表明，-胡蘿卜素的超級生產(chǎn)物，即三孢布拉氏霉菌，在工業(yè)上是用來

3、生產(chǎn)-胡蘿卜素的。/l（培養(yǎng)基）成為可能，但是，生物調(diào)節(jié)劑的作用機(jī)理還不明確。阻止了生物工程的更進(jìn)一步發(fā)展。由于這個(gè)原因，我們工作的目的是尋找新的生物合成番茄紅素的刺激劑，并闡明該合成過程和刺激劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，以及尋找一個(gè)新的方法來闡明三孢布拉氏霉菌在生物合成番茄紅素中的刺激作用的機(jī)理。材料與方法這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中使用了三孢布拉氏霉菌菌株（+）-A-732和（-）-A-732（由A.I.Kiseleva提供）。該菌絲體在添加了2%的葵花子油的玉米-大豆培養(yǎng)基，并在26-29。C，搖床（230-240r/min）作用下生長.該真菌在含有50ml該培養(yǎng)基的250ml容量瓶中生長。（+）/（-）孢子

4、比例為1：15的孢子懸液被用作接種體。 -胡蘿卜素和番茄紅素的含量是通過Unicam SP 1800分光光度計(jì)測得，或者使用丙酮提取真菌生物量，再用正己烷提取類胡蘿卜素之后使用SF-56 LOMO分光光度計(jì)測量；根據(jù)Brockman在4中的描述，在Al4+培養(yǎng)皿中用薄層色譜法測量。后者常用于測定-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、-胡蘿卜素和鏈孢紅素的含量；在4中出項(xiàng)的E值是用于計(jì)算這些多烴的含量的。 三孢布拉氏霉菌菌絲體的碳水化合物的分析 在沸水中煮二十分鐘后，提取四次碳水化合物。使用Dowex-50W(H+)和Dowex-1（醋酸鹽形式），通過離子交換色譜法移出蛋白質(zhì)，然后將純化的蛋白

5、質(zhì)樣本低壓凍干。碳水化合物然后轉(zhuǎn)化為三甲基甲硅烷衍生物，用5%的SE-30緩和的紅色硅藻色譜載體裝成的兩米玻璃柱,使用氣-液色譜法驗(yàn)證，用3700-模式氣-液色譜和從170到270。C溫度梯度。肌糖，葡萄糖，海藻糖，甘露糖，蔗糖，棉子糖被作為測定標(biāo)準(zhǔn)。 吡啶誘導(dǎo)劑和二氮氯圜的合成方法在3中描述過?？寡趸瘎▉喼Z抗氧化添加劑、6-已氧基二氫2，2，4-三甲基喹啉、VE、6-甲基-3-已基-3-羥基吡啶）由E.B.Burlakova和L.A.Vakulova提供。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做了三到四次。表中的數(shù)據(jù)代表了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。結(jié)果和討論 首先，我們研究了向生物合成番茄紅素的發(fā)酵培養(yǎng)皿中加入刺激劑的最佳時(shí)間

6、。在以前的實(shí)驗(yàn)中，三孢布拉氏霉菌的生長和在已用培養(yǎng)基中生物合成番茄紅素的動(dòng)力學(xué)已經(jīng)研究。三孢布拉氏霉菌的生物量在培養(yǎng)的第46-53h停止。到這個(gè)時(shí)間，菌絲體的合成量已經(jīng)大約為-胡蘿卜素在繁殖期最后合成量的一半。-胡蘿卜素最強(qiáng)烈的合成期為第二到第三天，并且生長過程強(qiáng)度有一個(gè)大的增長。 在含有2%的葵花子油的玉米-大豆培養(yǎng)基中三孢布拉氏霉菌和-胡蘿卜素?cái)?shù)量的動(dòng)態(tài)（1）生物量；（2）-胡蘿卜素根據(jù)在4，6中的數(shù)據(jù)，生物合成番茄紅素的刺激劑是2-氨基吡啶。這種復(fù)合物在生長的29h，46h，53h，77h加入到三孢布拉氏霉菌培養(yǎng)基中，闡明加入刺激劑的最佳時(shí)間。表1 三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素中加入2

7、-氨基吡啶的時(shí)間的作用注：C標(biāo)準(zhǔn)；E試驗(yàn)；下標(biāo)代表2-氨基吡啶的加入時(shí)間；所有的試驗(yàn)都做96h。 在培養(yǎng)的第53h向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入生物合成番茄紅素的刺激劑，得到這種類胡蘿卜素的最高產(chǎn)率（表1）。數(shù)據(jù)在表一中顯示，首先，在二氨基吡啶的作用下三孢布拉氏霉菌最強(qiáng)烈的生長菌絲與成熟的菌絲相比，合成了相當(dāng)小數(shù)量的番茄紅素。其次，與控制條件相比這種刺激劑輕微的抑制了幼小菌絲的生長和類胡蘿卜素（番茄紅素和-胡蘿卜素）的生物合成。同時(shí)，在加入二氨基吡啶的條件下由菌絲體轉(zhuǎn)換為染色相（46h），從而生物合成類胡蘿卜素的量有所增長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種生物調(diào)節(jié)劑不僅改變了類胡蘿卜素的組成，增加了番茄合成的生物合成，而

8、且刺激了這種菌絲體在一定生長階段生物合成番茄紅素。表2 三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素中吡啶的作用注：在加入吡啶誘導(dǎo)物的菌絲體中胡蘿卜素和番茄紅素的含量 各種吡啶誘導(dǎo)物對生物合成番茄紅素的作用的研究證明了吡啶雜環(huán)的化學(xué)作用（表2）。因此甲基群的介入雙倍的提高了番茄紅素的產(chǎn)率。在6位置上多一個(gè)甲基對番茄紅素的生物合成無效。在4位上的第三個(gè)甲基使二氮陸環(huán)的集中減少了一半，這種變體提供了集中力。在吡啶雜環(huán)上的一個(gè)氨基介入也可雙倍的減少這種刺激劑的集中。然而,取代氨基在雜環(huán)上的位置有顯著的作用（與2-和4-氨基吡啶相比）。在三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素中2，6-氨基吡啶最為有效。 在吡啶雜環(huán)上含有氨

9、基和甲基的（特別是在2和6位置）吡啶誘導(dǎo)劑對生物合成番茄紅素有顯著的刺激。在這種情況下，生物合成胡蘿卜素的阻凝劑的集中會(huì)減少十倍。以前，報(bào)道在雜環(huán)上的苯甲酰、N-氧化物、乙炔基或者在或位置上引入第二個(gè)雜環(huán)對番茄紅素的生物合成無效。哌啶氫氧化物（1g/l）與2-氨基吡啶的刺激作用相當(dāng)。 向上面所說的，除了取代吡啶外，許多三烴基銨氯化物刺激誘導(dǎo)番茄紅素的生物合成；然而，它們作用的機(jī)理還不清楚。盡管它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，這些復(fù)合物還是被認(rèn)為阻止了番茄紅素的環(huán)化和轉(zhuǎn)化為-和-胡蘿卜素。表3 三孢布拉氏霉菌生物合成類胡蘿卜素中DPA和PD的作用（菌絲體生長的第5天）×10-4M。CP-胡蘿卜素（

10、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素）的無色前體。 在吡啶的誘導(dǎo)作用下，特別是6-甲基-2氨基吡啶，由三孢布拉氏霉菌合成類胡蘿卜素的分析顯示了生物合成的誘導(dǎo)劑不僅是番茄紅素，而且是鏈孢紅素和-胡蘿卜素和八氫番茄紅素和六氫番茄紅素?zé)o色前體的誘導(dǎo)劑（表3）。在PD作用下合成類胡蘿卜素總的數(shù)量比在檢驗(yàn)下高。 在PD作用下由三孢布拉氏霉菌菌絲體合成多烯烴的數(shù)據(jù)顯示這些復(fù)合物不僅刺激了胡蘿卜素前體，包括無色的前體，而且阻止了脫氫酶。在這些考慮下，PD的作用類似于二苯胺的作用（表3），他阻止了-胡蘿卜素的生物合成，并且刺激鏈孢紅素、無色多烯和類胡蘿卜素前體。因此，PD刺激番茄紅素和多烯烴（八氫番茄紅素、六氫番茄紅素

11、、鏈孢紅素和八氫番茄紅素等等），PD抑制環(huán)化酶和脫氫酶，特別是移動(dòng)了氫原子使八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)榘藲浞鸭t素。為了闡明PD對生物合成類胡蘿卜素酶的作用機(jī)理，這些抑制劑的水平，特別是6-甲基-2氨基吡啶，應(yīng)該說明操作過程。我們研究了放線酮和防線菌D，生物合成蛋白質(zhì)和核酸的抑制劑，特別是轉(zhuǎn)化和復(fù)制。向加入了生物合成番茄紅素刺激劑的三孢布拉氏霉菌中加入放線酮（50l/ml）,顯著抑制了番茄紅素的生物合成（PD作用下7060l/ml）。表明，放線酮抑制了-胡蘿卜素的生物合成，但是使番茄紅素增長3-4倍。表4 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡蘿卜素和番茄紅素中CHI和AD的作用注：C-5353h 的菌絲體，C-

12、7777h的菌絲體；C-53+CHI-C-77在培養(yǎng)53h后加入CHI中生長。在其它試驗(yàn)中，在培養(yǎng)53h后加入6-甲基-2-氨基吡啶或AD。AD(20g/ml)產(chǎn)生了不同的作用，這種核酸的抑制劑也抵抗PD的作用抑制了番茄紅素的生物合成，但是比CHI更少，實(shí)際上不影響-胡蘿卜素的產(chǎn)率。然而在有PD存在時(shí)AD對生物合成-胡蘿卜素的抑制能力更顯著（表4）。這些數(shù)據(jù)表明，PD影響生物合成蛋白質(zhì)是在轉(zhuǎn)化水平。考慮CHI高的集中，我們提出OD可能抑制基因調(diào)控了生物合成番茄紅素的特定酶的生物合成。因此，獲得的結(jié)果顯示PD不僅抑制胡蘿卜素-合成酶的生物合成，而且刺激番茄紅素合成酶的從頭合成。在有PD的情況下，

13、合成類胡蘿卜素的數(shù)量要高些，并且番茄紅素的數(shù)量要高100倍。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中-胡蘿卜素的數(shù)量沒有變，與向菌絲體中加PD前-胡蘿卜素的含量是相當(dāng)?shù)??？紤]到最后的假定，番茄紅素含量在有CHI和PD的情況下與只有CHI相比的輕微增加，值得考慮。這個(gè)現(xiàn)象可解釋為，三孢布拉氏霉菌的細(xì)胞質(zhì)和核糖體結(jié)合膜的不同蛋白質(zhì)合成作用，或者由于CHI在膜組織中mRNA的部分穩(wěn)定。表4中的結(jié)果顯示AD在復(fù)制水平上抑制番茄紅素的生物合成，而PD部分釋放AD的抑制能力。有趣的是與-胡蘿卜素相比，番茄紅素的生物合成中AD抑制的復(fù)制產(chǎn)生了更顯著的作用。加AD后在三孢布拉氏霉菌中番茄紅素的產(chǎn)率的降低可能與AD部分抑制轉(zhuǎn)化有關(guān)，這個(gè)

14、在14中描述過。氮雜-和5-鹵素的吡啶誘導(dǎo)劑基質(zhì)被認(rèn)為是抑制核酸的生物合成。許多復(fù)合物，例如：葉酸，消除這些吡啶誘導(dǎo)劑的作用。表5 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡蘿卜素和番茄紅素中5-嗅尿嘧啶（/l）的作用注：5-BU5-嗅尿嘧啶。表5中的結(jié)果顯示，在有PD的條件下，核酸生物合成的抑制劑對-胡蘿卜素和番茄紅素的生物合成無效，但是降低了類胡蘿卜素的產(chǎn)率嗅尿嘧啶最有效。這個(gè)符合物抑制了酶的生物合成，可能是依靠DNA的RNA聚合酶2，從而影響蛋白質(zhì)和環(huán)化酶的從頭合成。與催化脫氫酶的作用相比，番茄紅素成環(huán)為-和-胡蘿卜素是一個(gè)敏感的氧化反應(yīng)8。因此，我們假設(shè)一定的氧化物能調(diào)節(jié)番茄紅素環(huán)化為-胡蘿卜素。表6

15、 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡蘿卜素和番茄紅素中抗氧化劑的作用注：MEHP6-甲基-3-已基-3-羥基吡啶?？寡趸瘎┘偃绲淖罱K濃度為/l。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們研究了各種各樣的氧化物（AO），例如：VE，甲氯喹啉，亞諾抗氧化添加劑和6-甲基-3-已基-3-羥基吡啶（MEHP），把這些加入培養(yǎng)基中抵消生物合成番茄紅素的刺激劑（表6）。6-已氧基二氫2，2，4-三甲基喹啉、亞諾抗氧化添加劑和VE抑制了生物合成番茄紅素。利用MEHP獲得的結(jié)果不同；這個(gè)氧化物，根據(jù)以前獲得的數(shù)據(jù)5，與上述的氧化物截然不同，能夠刺激真菌的生長，對類脂物膜產(chǎn)生抗氧化作用，它的性質(zhì)與天然真菌抗氧化物相近。在加入PD后加入ME

16、HP，它增加合成類胡蘿卜素的總產(chǎn)率，并且刺激生物合成番茄紅素。MEHP的加入是為了對在PD作用下生物合成番茄紅素產(chǎn)生一種額外的作用。MEHP對生物合成-胡蘿卜素也產(chǎn)生一種額外的作用；然而，這個(gè)刺激作用對生物合成番茄紅素不是很顯著。在這次工作中，我們研究了吡啶誘導(dǎo)劑對生物合成番茄紅素的作用，并揭示了最顯著的刺激作用與氨基和甲基組出現(xiàn)在吡啶雜環(huán)2位置的關(guān)系。獲得了PD刺激作用機(jī)理的數(shù)據(jù)。這些復(fù)合物，特別是2-氨基-6-甲基吡啶增加番茄紅素和多烯烴（鏈孢紅素和八氫番茄紅素、六氫番茄紅素）的產(chǎn)率。這些讓我們假定PD不僅抑制番茄紅素環(huán)化酶環(huán)化成-胡蘿卜素，而且影響類胡蘿卜素脫氫的作用，例如，影響脫氫酶。

17、用生物合成蛋白質(zhì)和核酸的抑制劑發(fā)現(xiàn)PD很可能作用在核糖體mPNA轉(zhuǎn)化水平上?？紤]到這些，PD與-紫羅酮、三孢酸和VA相似。加如氧化劑，特別是MEHP，增加生物合成番茄紅素，然而允許我們假定在三孢布拉氏霉菌番茄紅素的生物作用。-胡蘿卜素是三孢酸、異宗配合的真菌激素苛爾蒙的前體，因此，它通過受精卵形成，著手性的重建。在培養(yǎng)基中引入中毒的PD可能會(huì)導(dǎo)致一個(gè)應(yīng)力。在這種情況下，生長和重新產(chǎn)生的過程會(huì)很快阻止7，可能是由于番茄紅素替代-胡蘿卜素的生物合成。我們假定生物合成番茄紅素由抑制和刺激環(huán)化酶的從頭合成來調(diào)節(jié)，特別是由加入相應(yīng)的氧化物提供的脫氫酶。表7 由含有三孢布拉氏霉菌的碳水化合物生物合成番茄紅素中，刺激劑的作用注：C053h的菌絲體；C170h的菌絲體；C1+6-M-2-AP在培養(yǎng)53h后加入刺激劑的70h菌絲體；C2+6-M-2-AP在培養(yǎng)53h后加入刺激劑的84h菌絲體；C284h的菌絲體；X未辨別出的