實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：黃酮提取

1、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：木芙蓉花中有效成份提取與性能研究 主講教師：倪明主講教師：倪明一、目的與要求v1了解植物中有效成份的藥用價(jià)值。v2掌握植物中有效成份的提取及其測(cè)定方法。v3掌握抑制亞硝化反應(yīng)的操作與方法。二、實(shí)驗(yàn)原理與相關(guān)知識(shí)v黃酮類化合物泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)（黃酮類化合物泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)（A-與與B-環(huán)）通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列環(huán)）通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為化合物，其基本母核為2-苯基色原酮。是一大類苯基色原酮。是一大類以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的酚類化合物。植物中由苯丙以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的酚類化合物。植物中由苯丙氨酸產(chǎn)生的肉桂酰輔酶氨酸產(chǎn)生的肉

2、桂酰輔酶A，經(jīng)碳鏈延長環(huán)化生成，經(jīng)碳鏈延長環(huán)化生成的查耳酮，再衍生成的各種的查耳酮，再衍生成的各種-苯基衍生物。苯基衍生物。OOAB2-苯基色原酮二、實(shí)驗(yàn)原理與相關(guān)知識(shí) 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán)。此外，它還常與糖結(jié)合成苷。天然黃酮類化合物多以苷類形式存在，并且由于糖的種類、數(shù)量、聯(lián)接位置及聯(lián)接方式不同可以組成各種各樣黃酮苷類。組成黃酮苷的糖類包括單糖、雙糖、三糖和?；?。黃酮苷固體為無定形粉末，其余黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體。黃酮類化合物不同的顏色為天然色素家族添加了更多色彩。這是由于其母核內(nèi)形成交叉共軛體系，并通過電子轉(zhuǎn)移、重排，使共軛鏈延長，因而顯現(xiàn)

3、出顏色。黃酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等極性強(qiáng)的溶劑中；但難溶于或不溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑中。糖鏈越長則水溶度越大。黃酮類化合物因分子中多具有酚羥基，故顯酸性。酸性強(qiáng)弱因酚羥基數(shù)目、位置而異。黃酮類化合物廣泛存在于天然產(chǎn)物中，大多具有明顯的抗炎、抗菌、生物抗氧化性、抗衰老、降血脂、治療心血管疾病等功能。其中有些可用于心血管病的治療。二、實(shí)驗(yàn)原理與相關(guān)知識(shí)植物單寧植物單寧(Vegetable tannins)，又稱植物多酚，又稱植物多酚(Plant Polyphenol)為多羥基苯，為多羥基苯，如苯二酚、苯三酚等，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物。在維管如苯二酚、苯三酚等，是一類廣泛存在于

4、植物體內(nèi)的多元酚化合物。在維管植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，廣泛存在于植物的皮、根、植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，廣泛存在于植物的皮、根、葉、果中，含量可達(dá)葉、果中，含量可達(dá)20%。植物單寧是植物的次生代謝產(chǎn)物，屬于天然有機(jī)。植物單寧是植物的次生代謝產(chǎn)物，屬于天然有機(jī)化合物。常是植物及微生物中產(chǎn)生的酚類次生代謝產(chǎn)物。具有抗氧化性、抗化合物。常是植物及微生物中產(chǎn)生的酚類次生代謝產(chǎn)物。具有抗氧化性、抗腫瘤、抗動(dòng)脈硬化、防冠心病與中風(fēng)等心腦血管病以及抗菌等多種生理功能，腫瘤、抗動(dòng)脈硬化、防冠心病與中風(fēng)等心腦血管病以及抗菌等多種生理功能，是自然界和人類的是自然界和人類的“健

5、康衛(wèi)士健康衛(wèi)士”。2l世紀(jì)隨著抗氧化劑理論及研究工作的深世紀(jì)隨著抗氧化劑理論及研究工作的深入，以及消費(fèi)者對(duì)食品安全性意識(shí)的提高，天然抗氧化劑的應(yīng)用越來越受到入，以及消費(fèi)者對(duì)食品安全性意識(shí)的提高，天然抗氧化劑的應(yīng)用越來越受到人們的重視，回歸大自然已是目前一個(gè)大趨勢(shì)。木芙蓉（人們的重視，回歸大自然已是目前一個(gè)大趨勢(shì)。木芙蓉（Hibiscus mutabilis L.）為錦葵科植物，又名拒霜花、木蓮、醉芙蓉，為落葉灌木或）為錦葵科植物，又名拒霜花、木蓮、醉芙蓉，為落葉灌木或小喬木。其花大色艷，花色一日三變，在寒涼的深秋傲霜怒放，觀賞價(jià)值極小喬木。其花大色艷，花色一日三變，在寒涼的深秋傲霜怒放，觀賞價(jià)

6、值極佳。其花、葉、根富含生化藥物成分，是極優(yōu)良的中藥材。中醫(yī)認(rèn)為，木芙佳。其花、葉、根富含生化藥物成分，是極優(yōu)良的中藥材。中醫(yī)認(rèn)為，木芙蓉性平味辛，有清熱、涼血、解毒、消腫、排毒之功效，適用于肺熱咳嗽、蓉性平味辛，有清熱、涼血、解毒、消腫、排毒之功效，適用于肺熱咳嗽、月經(jīng)過多、白帶過多、癰疽腫毒、疔瘡、水火燙傷等疾病。月經(jīng)過多、白帶過多、癰疽腫毒、疔瘡、水火燙傷等疾病。本草綱目本草綱目言言其其“治一切大小癰疽，腫毒惡瘡，消腫，排膿，止痛治一切大小癰疽，腫毒惡瘡，消腫，排膿，止痛”。木芙蓉花、葉中含。木芙蓉花、葉中含有多酚、黃酮類化合物。有多酚、黃酮類化合物。二、實(shí)驗(yàn)原理與相關(guān)知識(shí)v1.測(cè)定總黃

7、酮的原理測(cè)定總黃酮的原理:v在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下,黃酮類化合黃酮類化合物先與亞硝酸鈉發(fā)生氧化還原反應(yīng)，物先與亞硝酸鈉發(fā)生氧化還原反應(yīng)， 再加硝酸鋁絡(luò)再加硝酸鋁絡(luò)合，最后加氫氧化鈉溶液使黃酮類化合物開環(huán)，生合，最后加氫氧化鈉溶液使黃酮類化合物開環(huán)，生成成 2-羥基查耳酮而顯紅橙色羥基查耳酮而顯紅橙色,在在510 nm波長處有吸波長處有吸收峰且符合定量分析的比爾定律收峰且符合定量分析的比爾定律,一般與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系一般與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量（它的顯色原理發(fā)生在黃酮醇類成分鄰列比較定量（它的顯色原理發(fā)生在黃酮醇類成分鄰位無取代的鄰二酚羥基部位位無取代的鄰二

8、酚羥基部位,不具有鄰位無取代鄰二不具有鄰位無取代鄰二酚羥基的黃酮醇類成分加入上述試劑時(shí)是不顯色酚羥基的黃酮醇類成分加入上述試劑時(shí)是不顯色的）。的）。二、實(shí)驗(yàn)原理與相關(guān)知識(shí)v 2.多酚測(cè)定原理多酚測(cè)定原理:v總多酚的測(cè)定采用總多酚的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定總多酚法測(cè)定總多酚含量，其反應(yīng)原理為酚類化合物在堿性條件下可含量，其反應(yīng)原理為酚類化合物在堿性條件下可以將鎢鉬酸還原，生成藍(lán)色的化合物，顏色的深以將鎢鉬酸還原，生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺與酚類化合物含量呈正相關(guān)，在波長淺與酚類化合物含量呈正相關(guān)，在波長760 nm左左右有最大吸收，一般與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列比較定右有最大吸收，

9、一般與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量量 。二、實(shí)驗(yàn)原理與相關(guān)知識(shí)v3.總黃酮對(duì)亞硝酸鈉清除率的測(cè)定v亞硝酸鈉在弱酸性條件下，與對(duì)氨基苯磺酸重氮化，然后再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色化合物，用分光光度計(jì)測(cè)出該化合物的吸光度，就可知道反應(yīng)液中亞硝酸鈉含量多少。據(jù)此可以通過測(cè)定相同條件下亞硝酸鈉含量的變化反映總黃酮清除能力的強(qiáng)弱，亞硝酸鈉含量少，總黃酮清除能力就強(qiáng)，反之則弱。二、實(shí)驗(yàn)原理與相關(guān)知識(shí) 4.總黃酮對(duì)亞硝胺合成阻斷率的測(cè)定 二甲胺與亞硝酸鈉在模擬人體胃液的條件下(pH 3.0，溫度37)，可適宜地生成二甲基亞硝胺。當(dāng)往樣品溶液中依次加入二甲胺與亞硝酸鈉時(shí)，樣品溶液優(yōu)先同亞硝酸鈉作用，使得二甲胺不能

10、與亞硝酸鈉反應(yīng)，達(dá)到阻止亞硝胺生成的目的。據(jù)此可以通過比較相同條件下生成亞硝胺量的多少反映總黃酮阻斷能力的強(qiáng)弱，生成亞硝胺量少，總黃酮的阻斷能力就強(qiáng)，反之則弱。在紫外燈照射下，二甲基亞硝胺可分解成二甲基仲胺和亞硝酸根，亞硝酸根與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與1-萘胺偶合生成紅色化合物，用分光光度計(jì)測(cè)出該化合物的吸光度，就可知道上述反應(yīng)液中亞硝胺含量多少。三、儀器與試劑v （一）實(shí)驗(yàn)室提供下列儀器和試劑v 1、儀器：v 電子分析天平；粉碎機(jī)；數(shù)顯恒溫水浴鍋；三用紫外儀；真空泵；分光光度計(jì)；電熱套；比色管；常用玻璃儀器。v 2、試劑：v 木芙蓉花采自湖北師范學(xué)院校區(qū)；蘆?。ㄉ虾Ｕ乖苹び邢薰荆粚?duì)氨

11、基苯磺酸（分析純）；檸檬酸（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；鹽酸萘乙二胺（分析純）；二甲胺（分析純）；1-萘胺（分析純）；鎢酸鈉（分析純）；鉬酸鈉（分析純）；沒食子酸（分析純）；（分析純）；乙醇（分析純）；A1(NO3)3（分析純）；鹽酸（分析純）；NaOH（分析純）；濃H2SO4（分析純）；磷酸（分析純）。三、儀器與試劑v （二）學(xué)生自配及標(biāo)定試劑v 1、乙醇溶液：60 %、80 %乙醇溶液。v 2、10% A1(NO3)3溶液。v 3、1 %三氯化鋁溶液。v 4、2FeCl3溶液。v 5、5 % NaNO2溶液。v 6、4 % NaOH 溶液；1 % NaOH 溶液。v 7、5的醋酸鉛溶液

12、。v 8、1KMnO4溶液。v 9、10 % 、0.5% Na2CO3溶液。v 10、pH3.0 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液:4.11 mL0.2 mol/L磷酸氫二鈉與15.89 mL0.1 mol/L檸檬酸混合即可。v 11、1 mmol/L 的二甲胺溶液。v 12、1% 、0.4 %對(duì)氨基苯磺酸溶液。v 13、0.1% 1-萘胺溶液。v 14、0.2% 鹽酸萘乙二胺溶液。v 15、0.4 % 對(duì)氨基苯磺酸溶液。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v一、一、樣品的處理及提取v1. 處理：新鮮木芙蓉花水洗后，于60烘干，粉碎機(jī)粉碎，過篩備用。v2. 提取：精密稱取干燥、粉碎的木芙蓉花粉末1.0000 g置于錐形

13、瓶中，加入60 %乙醇溶液30mL，于60浸提2 h，濾去殘?jiān)?，殘?jiān)礈?-3次，定容至100 mL，即得提取液。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v二、樣品測(cè)定v1. 黃酮測(cè)定v1.1 黃酮類物質(zhì)的鑒定方法v(1)鹽酸一鎂粉反應(yīng)：取待測(cè)液1.0 mL放在測(cè)試瓶中，加入少許鎂粉振搖，滴加幾滴濃鹽酸，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。v(2)氨水反應(yīng)：取待測(cè)液1.0 mL放在測(cè)試瓶中，滴加幾滴氨水振搖，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。v(3)硝酸鋁反應(yīng)：取待測(cè)液1.0 mL放在測(cè)試瓶中，滴加幾滴硝酸鋁振搖，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。v(4)三氯化鋁反應(yīng)：取待測(cè)液1.0 mL放在測(cè)試瓶中，滴加幾滴1 %三氯化鋁振搖，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v (5)氯化鐵反

14、應(yīng)：在試管中加1 mL提取物，再加入1.0 mL的2FeCl3，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。v (6)濃硫酸反應(yīng): 在樣品液中滴加少量濃H2SO4溶液，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。v (7)堿性試劑顯色反應(yīng)在樣品液中加入5 % NaNO2溶液; 搖勻，旋轉(zhuǎn)6 min 后，加入等體積10% A1(NO3)3溶液，6 min 后再加入4 % NaOH 溶液，混勻，用60 %乙醇稀釋，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。v (8)與5的醋酸鉛反應(yīng)：在5的醋酸鉛溶液中滴加數(shù)滴提取物，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。v (9)與1高錳酸鉀溶液反應(yīng)：在試管中加10 mL 1KMnO4，滴入34滴提取物，觀察KMnO4溶液是否褪色。v (10)與堿性試劑(1NaOH)反應(yīng)：

15、在1 mL提取物中加入05 mL的1NaOH，觀察顏色變化。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v 1.2 黃酮類物質(zhì)定量測(cè)定v1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備v精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加80%乙醇溶解至刻度，搖勻即得對(duì)照品溶液。分別精密吸取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL和5.0 mL置于10mL比色管中，各加80%乙醇至5 mL，加5% NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加10 % A1(NO3)3。溶液0.5 mL，搖勻，再放置6 min，加4 % NaOH溶液4mL，搖勻放置15min，在510 nm波長處，以同法配制空白對(duì)照，測(cè)定吸光度值，得回歸

16、方程。v1.2.2 樣品黃酮含量測(cè)定v精密吸取提取液1.0 mL于10 mL比色管中，按“各加80 %乙醇至5 mL”起依法進(jìn)行操作，同時(shí)精密吸取黃酮提取液1.0 mL于10 mL比色管中，加80 %乙醇至5 mL，再加1mL水，4 mL4 %NaOH溶液，作樣品空白測(cè)定吸光度值。按回歸方程計(jì)算樣品黃酮提取得率。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v2.多酚測(cè)定v2.1 福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑的配制v稱取100 g鎢酸鈉和25 g鉬酸鈉置于2L的磨口圓底燒瓶中，用700 mL蒸餾水溶解，再緩慢加入50 mL 85 %的磷酸和100 mL的濃鹽酸，充分混勻，放入數(shù)粒玻璃珠，連接回流冷凝裝置，文

17、火回流10 h。用50mL蒸餾水沖洗冷凝管上的附著物，拆開冷凝管后加入150 g無水硫酸鋰和幾滴溴水（邊加邊搖晃），開口繼續(xù)加熱沸騰15 min，使溴水完全揮發(fā)為止，終點(diǎn)顏色為黃綠色。冷卻后定容至1000 mL，過濾，儲(chǔ)存于棕色瓶中，放入冰箱中保存?zhèn)溆?。四、四、?shí)驗(yàn)步驟v2.2 制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線v精確稱取0.070 g的干燥沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解，定容于100 mL的容量瓶中，配成濃度為700 mg/L的沒食子酸溶液。然后分別精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定容于50 mL容量瓶內(nèi)，配成濃度為0-56 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。再從各系列

18、標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取1mL于25 mL比色管內(nèi)，加10 mL蒸餾水，搖勻，再加1.5 mL Folin- Ciocalteu試劑，充分搖勻，立即加入6 mL 10 % Na2CO3溶液，混勻，加水定容，再混勻，然后在30下避光放置反應(yīng)2 h，以試劑樣為空白，在波長760 nm處測(cè)定吸光值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v2.3 多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu反應(yīng)比色法v取1mL提取稀釋液（樣液稀釋10倍）于25mL比色管內(nèi)，加10 mL蒸餾水，搖勻，再加1.5 mL Folin- Ciocalteu試劑，充分搖勻，立即加入6 mL10 %

19、Na2CO3溶液，混勻，加水定容，再混勻，然后在30下避光放置反應(yīng)2 h，以試劑樣為空白，在波長760 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算提取液中多酚含量(以沒食子酸計(jì))，經(jīng)進(jìn)一步計(jì)算即得多酚提取得率。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v3.抑制亞硝化反應(yīng)v3.1 總黃酮對(duì)亞硝酸鈉清除率的測(cè)定v分別吸取50 mg/L的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL于6支25 mL比色管中，再分別加入提取液0.0、1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0 mL，加入pH3.0 的檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖液10 mL， 37條件下反應(yīng)1h。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4 % 對(duì)氨基苯磺酸2.0 mL，搖勻靜置5 min，再加入質(zhì)

20、量分?jǐn)?shù)0.2% 鹽酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min。在確定的最大吸收波長max = 540 nm 處測(cè)定吸光度，并計(jì)算總黃酮對(duì)亞硝酸鈉清除率。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v 3.2 總黃酮對(duì)亞硝胺合成阻斷率的測(cè)定v 分別吸取總黃酮提取液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，于6支25 mL 比色管中。加入pH 3.0 的檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖液10 mL，1 mmol/L 的NaNO2 溶液1.0 mL，1 mmol/L 的二甲胺溶液1.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，在37條件下恒溫1 h。用移液管吸取1.0mL 上述溶液加到7 cm2 培養(yǎng)皿中，加入質(zhì)量

21、分?jǐn)?shù)0.5% Na2CO3 溶液0.5 mL，于紫外分析儀(254nm 波長)上輻照15 min。取出后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 對(duì)氨基苯磺酸1.5 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% 1-萘胺1.5 mL，蒸餾水0.5 mL，搖勻靜置15 min。用分光光度計(jì)在確定的最大吸收波長max = 525 nm 處測(cè)吸光度，計(jì)算總黃酮對(duì)亞硝胺合成阻斷率。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟v 1. 黃酮測(cè)定v 1.1 黃酮類物質(zhì)的鑒定方法v (1)鹽酸一鎂粉反應(yīng)：取待測(cè)液10 mL放在測(cè)試瓶中，加入少許鎂粉振搖，滴加幾滴濃鹽酸，產(chǎn)生泡沫反應(yīng)，反應(yīng)完后溶液呈橙紅色，表明有黃酮類化合物。v (2)氨水反應(yīng)：取待測(cè)液10 mL放在測(cè)試瓶

22、中，滴加幾滴氨水振搖，反應(yīng)完后溶液呈黃色，表明有黃酮類化合物。v (3)硝酸鋁反應(yīng)：取待測(cè)液10 mL放在測(cè)試瓶中，滴加幾滴硝酸鋁振搖。反應(yīng)完全后溶液呈黃色，表明有黃酮類化合物。v (4)三氯化鋁反應(yīng)：取待測(cè)液10 mL放在測(cè)試瓶中，滴加幾滴1 %三氯化鋁振搖，反應(yīng)完全后溶液呈黃色，表明有黃酮類化合物。v (5)氯化鐵反應(yīng)：在試管中加1 mL提取物，再加入10 mL的2FeCl3，若呈藍(lán)綠色或綠色，表明含有酚類化合物。五、五、結(jié)果與分析結(jié)果與分析v (6)濃硫酸反應(yīng): 在樣品液中滴加少量濃H2SO4溶液，觀察反應(yīng)顏色變橙色，表明有黃酮類化合物。v (7)堿性試劑顯色反應(yīng)在樣品液中加入5 % N

23、aNO2溶液; 搖勻，旋轉(zhuǎn)6 min 后，加入等體積10% A1(NO3)3溶液，6 min 后再加入4 % NaOH 溶液，混勻，用65 %乙醇稀釋，觀察反應(yīng)顏色變橙紅色，表明有黃酮類化合物。v (8)與5的醋酸鉛反應(yīng)：在5的醋酸鉛溶液中滴加數(shù)滴提取物，有黃色沉淀產(chǎn)生的表示有黃酮類成分。v (9)與1高錳酸鉀溶液反應(yīng)：在試管中加1.0 mL 1KMnO4，滴入34滴提取物，觀察KMnO4溶液是否褪色，若褪色表明含有酚類化合物。v (10)與堿性試劑(1NaOH)反應(yīng)：在1 mL提取物中加入05 mL的1NaOH，觀察顏色變化，若呈黃色、橙色或紅色，表明含有黃酮類成分。五、五、結(jié)果與分析結(jié)果與分析五、五、結(jié)果與分析結(jié)果與分析v2.樣品黃酮提取含量按照如下公式計(jì)算v式中：Y：黃酮提取含量（%）；vV：提取黃酮液體積（mL）；vC：提取原液中黃酮的濃度（g/mL）；vM：木芙