SBC基因芯片研究骨肉瘤發(fā)病轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其發(fā)現(xiàn)

1、SBC基因芯片研究骨肉瘤發(fā)病轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其發(fā)現(xiàn) 作者：曹磊，紀(jì)方，蔡曉冰，唐昊，竺偉，張瑞【摘要】 目的 運(yùn)用基因芯片技術(shù)探索骨肉瘤發(fā)病及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，研究基因表達(dá)水平對(duì)于骨肉瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的重要意義。方法 采用2個(gè)公認(rèn)的骨肉瘤細(xì)胞株及1個(gè)成骨細(xì)胞株，提取總RNA,合成生物素標(biāo)記的cRNA與SBC基因芯片雜交。隨機(jī)挑選4個(gè)差異表達(dá)基因，分別設(shè)計(jì)合成引物，用嵌合熒光法（SYBR Green I）實(shí)時(shí)RT-PCR法定量測(cè)量術(shù)中收集的新鮮骨肉瘤標(biāo)本及兩株細(xì)胞中各基因的表達(dá)水平，應(yīng)用ABI Prism 7 300分析其與成骨細(xì)胞株之間的表達(dá)差異。結(jié)果以表達(dá)差異2.0或0.5倍為限，在SBC芯片包含的所

2、有基因（約15 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本）中，2個(gè)骨肉瘤細(xì)胞株與成骨細(xì)胞株相比較，共同上調(diào)189個(gè)基因；共同下調(diào)84個(gè)基因。隨機(jī)挑選4個(gè)差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果完全相符。結(jié)論骨肉瘤是一種多基因病變,應(yīng)用基因芯片技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)該腫瘤的基因變化規(guī)律。 【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤; 基因微矩陣； 基因 Abstract: ObjectiveTo investigation the relavant genes to the pathogenesis and metastasis of osteosarcoma,and to discuss the significance of gene expr

3、ession in the pathogenesis and metastasis of osteosarcoma. MethodTwo well-known ATCC osteosarcoma cell lines and an osteoblastic cell line were collected. After the total RNA was extracted,the finally synthesized biotinylated cRNAs were hybridized to SBC arrays.After the design and synthethesis of t

4、he primers,four of the differentially expressed genes were then chosen at random to further confirm the array results using the SYBR Green real-time RT-PCR method in freshly collected osteosarcoma specimens and the cell lines.The data analysis depended on the ABI Prism 7300 system.ResultBy an entran

5、ce limit of 2.0 or 0.5, 189 up-regulated and 84 dowm-regulated genes which were considerable differentially expressed in the two osteosarcoma cell lines compared with the osteoblastic cell line hfob1.19 were finally detected.Many of the genes were first reported to be related to the pathogenesis of

6、osteosarcoma. The array results were further confirmed by the real-time RT-PCR.ConclusionMany genes are involved in the pathogenesis and metastasis of osteosarcoma. It is helpful to apply gene array to find the laws of gene expression and to study the gene-gene interactional relationships in this tu

7、mor. Key words：osteosarcoma; gene microarray; gene 目前研究認(rèn)為，骨肉瘤的發(fā)生與癌基因激活，抑癌基因失活及其它基因的表達(dá)失控有關(guān)，是多種相關(guān)基因多階段多途徑協(xié)同作用的結(jié)果?；蛐酒址Q(chēng)DNA芯片或DNA微陣列，該技術(shù)由于采用了微電子學(xué)的并行處理和高密度集成的概念，具有高效、高信息量的突出優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以骨肉瘤細(xì)胞系（MG-63，U-2OS）和成骨細(xì)胞系hFOB1.19為研究對(duì)象，應(yīng)用SBC的人16K基因表達(dá)譜cDNA芯片(含已知基因12581個(gè))，通過(guò)一次重復(fù)，鑒定已知基因在骨肉瘤細(xì)胞與正常成骨細(xì)胞中的差異表達(dá)情況，并以臨床切除的骨肉瘤新鮮標(biāo)本及

8、兩個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系為對(duì)象，進(jìn)一步在mRNA水平上對(duì)顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行了驗(yàn)證。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，由基因芯片篩選到的差異表達(dá)基因與骨肉瘤的發(fā)病與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。骨肉瘤的發(fā)病及轉(zhuǎn)移是一個(gè)包括癌基因、抑癌基因、腫瘤相關(guān)基因等多基因參與的復(fù)雜過(guò)程。 1 材料與方法 1.1 主要材料與試劑 兩個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系（MG-63、U-2OS）及一個(gè)成骨細(xì)胞系(hFOB1.19)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。MEM、McCoys 5a培養(yǎng)基、10%滅活胎牛血清、0.3 mg/ml G418、TRIzol試劑購(gòu)自GIBCO公司，Hams F12及無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基（11）均購(gòu)自SIGMA公司。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司

9、合成。反轉(zhuǎn)錄試劑由invitorge公司提供；定量PCR試劑為ABI power SYBR green PCR master mix (ABI, USA)；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；定量PCR儀型號(hào)為7 300 Sequence detection system (ABI, USA)。實(shí)驗(yàn)所用的骨肉瘤組織標(biāo)本為2007年12月份第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院骨科手術(shù)切除標(biāo)本。術(shù)中切除后立即置入液氮罐中凍存?zhèn)溆??；颊吣行裕?5歲，為右股骨遠(yuǎn)段骨肉瘤，組織樣本均經(jīng)長(zhǎng)海醫(yī)院病理科免疫病理確診為骨肉瘤，其組織分型為成骨細(xì)胞型。 1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MG-63采用MEM培養(yǎng)基，添加10%滅活胎牛血清；U-

10、2OS采用McCoys 5a培養(yǎng)基，添加1.5 mmol/L-谷胺酰胺及10%滅活胎牛血清。兩個(gè)骨肉瘤細(xì)胞株（MG-63、U-2OS）均在37、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。hFOB1.19成骨細(xì)胞株在34、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用的Hams F12及無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基（11）中添加2.5 mmol/L-谷胺酰胺、10%滅活胎牛血清。所有用于芯片實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株總RNA抽提及探針合成 將三個(gè)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株各收集1×107左右的細(xì)胞用于抽提總RNA。采用TRIzol法抽提總RNA、QIAGEN RNAeasy mini kit純化總

11、RNA（具體見(jiàn)QIAGEN公司提供的說(shuō)明手冊(cè)）。抽提總RNA的濃度和質(zhì)量采用分光光度計(jì)及瓊脂糖膠電泳測(cè)定。只有當(dāng)A260/A280吸收率為1.92.11且28S/18S RNA 亮度比值2且者才繼續(xù)進(jìn)行之后的操作。芯片雜交剩余的RNA保存于-80冰箱備用。 雙鏈cDNA的合成、熒光標(biāo)記cRNA的合成以及cRNA的片段化等過(guò)程嚴(yán)格遵循SBC芯片表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)方法。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)方法，cDNA的第1鏈、第2鏈以T7 promotor primer為引物配制cDNA合成體系運(yùn)用一步法合成；cRNA合成后以QIAGEN RNAeasy mini kit純化cRNA，以分光光度計(jì)分析cRNA濃度；cRNA以

12、熒光染料標(biāo)記（cy3標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，cy5標(biāo)記成骨細(xì)胞）后同上述方法進(jìn)行純化并定量。（具體操作步驟詳見(jiàn)SBC cDNA表達(dá)譜芯片操作指南）。 1.4 芯片雜交 cy3探針90 pmmol、cy5探針60 pmmol配制成雜交液后滴加與芯片上雜交過(guò)夜（芯片各做1組重復(fù)，共4張）。芯片雜交后的洗滌、染色過(guò)程遵照標(biāo)準(zhǔn)的SBC表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。 1.5 數(shù)據(jù)分析 芯片結(jié)果采用Aligent Scanner來(lái)獲取圖像，通過(guò)Imagene轉(zhuǎn)化為數(shù)值后應(yīng)用Genespring分析軟件將數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，取得Ratio值。一般認(rèn)為Ratio值在0.52.0范圍內(nèi)的基因不存在顯著的表達(dá)差異，而在該范圍之外的基

13、因被認(rèn)為表達(dá)出現(xiàn)顯著改變。作者將兩個(gè)骨肉瘤細(xì)胞株與成骨細(xì)胞株之間差異表達(dá)平均倍數(shù)（芯片重復(fù)一次）2.0倍或0.5者篩選出來(lái)，從篩選出的基因（2組上調(diào)、2組下調(diào)）中選擇兩組骨肉瘤細(xì)胞株相對(duì)成骨細(xì)胞株共同差異表達(dá)的基因（上調(diào)和下調(diào)）。具體見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)共同差異表達(dá)基因的分析借助于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)、Genespring等綜合完成。 1.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證 骨肉瘤組織標(biāo)本總RNA用一步法（TRIzol試劑，GIBCO/BRL公司）提取后全部保存在-80冰箱備用。 cDNA第1鏈合成：從-80冰箱中取出骨肉瘤組織及3個(gè)細(xì)胞株RNA，在室溫下解凍，然后在0.2 ml PCR管中配制反應(yīng)溶液；

14、將反應(yīng)管置于PCR儀中,65預(yù)變性5 min；變性反應(yīng)結(jié)束后在PCR管中配制cDNA第1鏈合成反應(yīng)體系（5X first-strand buffer 4.0 l、0.1 MDTT 2.0 l、RNA inhibitor 1.0 l、Superscript II 1.0 l）；將PCR管子置于PCR儀中進(jìn)行探針標(biāo)記反應(yīng)，42保溫50 min后，70變性15 min，4保存。 引物的設(shè)計(jì)：登錄GENEBANK網(wǎng)站，以4個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)槟０嬖O(shè)計(jì)上、下游引物，引物的合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司（具體見(jiàn)表1）。表1 定量PCR引物列表基因名稱(chēng)Genbank號(hào) 嵌合熒光法（SYBR Green I）實(shí)時(shí)

15、RT-PCR：采用ABI SYBR Green RT-PCR方法（具體反應(yīng)體系見(jiàn)ABI SYBR Green RT-PCR方法說(shuō)明）50孵育2 min；然后95，10 min；接著進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，95，15秒；60，1 min。儀器使用ABI Prism 7 300。 2 結(jié)果 2.1 骨肉瘤細(xì)胞株與成骨細(xì)胞株差異基因表達(dá)情況 以表達(dá)差異2倍或0.5為限，在SBC人16K基因表達(dá)譜cDNA芯片包含的約12 581個(gè)已知基因中，2個(gè)骨肉瘤細(xì)胞株與成骨細(xì)胞株hFOB1.19分別的差異表達(dá)情況如下：MG-63上調(diào)842個(gè)基因，下調(diào)1 255個(gè)基因；U-2OS上調(diào)1 040個(gè)基因，下調(diào)1 430個(gè)基因

16、（差異基因功能分類(lèi)見(jiàn)表2）。 表2 MG-63、U-2OS與hFOB1.19相比較差異基因功能分類(lèi)MG-63上調(diào)MG-63下調(diào)U-2OS上調(diào)U-2OS下調(diào)凋亡或腫瘤相關(guān)120225147235結(jié)合226350294384代謝9細(xì)胞周期5210380115信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)6510977108物質(zhì)運(yùn)輸38435867轉(zhuǎn)錄調(diào)控35605560酶調(diào)節(jié)22431639未知功能28383443 注：MG-63上調(diào)代表MG-63與hFOB1.19相比較上調(diào)的基因數(shù)量，類(lèi)推其他三項(xiàng)?；虺醪焦δ芊诸?lèi)為16大類(lèi)，本表列舉主要的9類(lèi)。 兩者與成骨細(xì)胞株相比較共同上調(diào)189個(gè)基因；共同下調(diào)84個(gè)基因。 在189個(gè)共同上調(diào)基

17、因中，作者選取了MUC1（平均上調(diào)5.513和3.297倍）和ASS基因（平均上調(diào)達(dá)16.18、3.234倍）在組織標(biāo)本及細(xì)胞株中對(duì)其表達(dá)進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。 在84個(gè)共同下調(diào)基因中，我們選擇了IL-1B（平均下調(diào)0.019和0.01倍）、GDF15（平均下調(diào)0.0 232和0.0 473倍）兩個(gè)基因在組織標(biāo)本及細(xì)胞株中對(duì)其表達(dá)進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。 2.2 4個(gè)差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證 作者采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法驗(yàn)證了上述4個(gè)基因在臨床切除的1例骨肉瘤標(biāo)本及2個(gè)骨肉瘤細(xì)胞株與成骨細(xì)胞株細(xì)胞相比較的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明：在mRNA水平上，與成骨細(xì)胞株hFOB 1.19相比，原發(fā)骨肉瘤

18、組織標(biāo)本及骨肉瘤細(xì)胞株顯示與SBC芯片同樣的差異表達(dá)情況（見(jiàn)表3），這進(jìn)一步驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。 3 討論 雖然大量的研究結(jié)果表明骨肉瘤這種惡性程度極高的骨腫瘤在分子和細(xì)胞遺傳學(xué)上具有一些較普遍的、顯著的改變，但時(shí)至今日，骨肉瘤發(fā)病的分子遺傳學(xué)背景仍未探明。本研究中，作者使用骨肉瘤細(xì)胞株作為模型用以研究基因表達(dá)水平對(duì)于骨肉瘤發(fā)病及演變的重要意義。通過(guò)使用基因芯片技術(shù)，作者在基因組水平共篩查到273條共同顯著差異表達(dá)基因（含上調(diào)和下調(diào)基因各189和84條）。而后，作者挑選了4條顯著差異表達(dá)基因，在1例臨床切除并經(jīng)病理證實(shí)的骨肉瘤組織標(biāo)本及3個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株中使用嵌合熒光實(shí)時(shí)RT-PCR方法定量進(jìn)

19、行了驗(yàn)證。在差異表達(dá)基因的初步分析中，作者發(fā)現(xiàn)其中一部分基因與骨肉瘤發(fā)病、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道或尚未引起重視。表3 4個(gè)基因在骨肉瘤組織標(biāo)本中的定量PCR驗(yàn)證情況列表各基因Ct值/差異倍數(shù)MUC1ASSIL-1BGDF15MG-631.7481/109.0312.5149/48.0819.1258/0.005811.3066/0.0052U2-OS6.4044/4.3247.0747/2.03915.1258/0.000110.0759/0.0122肉瘤標(biāo)本6.3867/4.3776.5676/2.7228.0846/0.01198.4683/0.0373hFOB1.198.5

20、167/1.08.1023/1.01.6876/1.03.7236/1.0 注：Ct值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值是樣品Ct值減去管家基因（GAPDH）Ct值的差值。因?yàn)樽髡哒J(rèn)為管家基因的表達(dá)量在總mRNA中的比例是恒定的，因此基因A在樣品1和樣品2中的表達(dá)量比值為2-（Ct1-Ct2）。在本表中，上調(diào)基因差異倍數(shù)均2.0，下調(diào)基因差異倍數(shù)均0.5倍 在篩選出的差異基因中，無(wú)論上調(diào)基因還是下調(diào)基因，基本上包括所有功能的基因，但凋亡或腫瘤相關(guān)基因，代謝、結(jié)合、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因占絕大多數(shù)（見(jiàn)表2），這更充分說(shuō)明骨肉瘤的發(fā)生、演變與多個(gè)基因相關(guān)，是多因素

21、、多途徑作用的結(jié)果。骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤相關(guān)基因、細(xì)胞的調(diào)亡、代謝密切相關(guān)。 與對(duì)照成骨細(xì)胞株相比，骨肉瘤細(xì)胞株顯著共同差異表達(dá)的189個(gè)上調(diào)基因中包括了一些與能量代謝、物質(zhì)代謝密切相關(guān)的基因，如USP13、LOC220594、TSTA3、SENP7、PLCB1、NNT、NNMT等，這很顯然與骨肉瘤細(xì)胞的高代謝、高分化狀態(tài)有關(guān)，包括了一些細(xì)胞周期基因，如JRK、HOXC10、DLG5等基因，還包括結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸及未知功能基因等。而另外一些顯著上調(diào)的腫瘤相關(guān)基因引起了作者的重視，如與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因RASSF5、CDH11等。作者還發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)數(shù)量的腫瘤相關(guān)基因在骨肉瘤細(xì)胞株

22、中顯著高表達(dá)，這些腫瘤相關(guān)基因盡管已明確與多種其他系統(tǒng)腫瘤密切相關(guān)，但尚不知與骨肉瘤有無(wú)確切關(guān)系。（1）TPD52TPD52已被證實(shí)在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、惡性淋巴細(xì)胞瘤、白血病等多種腫瘤組織中高表達(dá)14。一些學(xué)者更指出TPD52是候選癌基因。在作者以往的研究已證明TPD52在骨肉瘤中呈高表達(dá)，未引起注意，本次實(shí)驗(yàn)再次表明，TPD52表達(dá)水平提高與骨肉瘤的發(fā)病具有密切聯(lián)系，值得密切關(guān)注。（2）CLU：Yan Lu5等采用大宗病歷分析在20種常見(jiàn)腫瘤（不包括骨肉瘤）中篩選共同差異基因并進(jìn)行驗(yàn)證后的得出CLU在常見(jiàn)腫瘤組織中呈高表達(dá)，這與作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，因此可以設(shè)想這種基因的表達(dá)產(chǎn)物是否

23、可成為一種新的腫瘤標(biāo)記物。（3）LSP1：編碼淋巴細(xì)胞特異性蛋白，有報(bào)道它的高表達(dá)與乳腺癌、黑色素瘤相關(guān)67，本次實(shí)驗(yàn)中，平均差異達(dá)12.81倍，強(qiáng)烈提示它與骨肉瘤的發(fā)生和演進(jìn)有關(guān)。（4）MUC1：在以往的研究中，MUC1的過(guò)度表達(dá)與乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸直腸癌等上皮源性腫瘤的增殖、分化及侵襲性密切相關(guān)810，目前尚無(wú)報(bào)道MUC1的表達(dá)與骨肉瘤的關(guān)系，作者的實(shí)驗(yàn)及驗(yàn)證證實(shí)MUC1可能與骨肉瘤的發(fā)生及惡性侵襲性密切相關(guān)。 在顯著共同差異表達(dá)的84個(gè)下調(diào)基因中，包括了一些早已在多種腫瘤中被證實(shí)了的抑癌基因，如：TXNIP、SIM2、RIS1等。還包括一些與腫瘤惡性進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，如

24、（1）CXCL6：已有多篇報(bào)道CXCL6的低表達(dá)與乳腺癌、卵巢癌的惡性侵襲及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系11，作者的實(shí)驗(yàn)提示其很有可能與骨肉瘤的惡性侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)；（2）SERPINB2：它的表達(dá)產(chǎn)物限制細(xì)胞的移動(dòng)及降低細(xì)胞的侵襲性，SERPINB2在腫瘤細(xì)胞的高表達(dá)多次證明與腫瘤的低轉(zhuǎn)移率及良好的預(yù)后有關(guān)12。骨肉瘤細(xì)胞SERPINB2表達(dá)明顯下調(diào)可能與腫瘤細(xì)胞侵襲性、轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系。在顯著下調(diào)基因中，有相當(dāng)數(shù)量的基因具有促使、介導(dǎo)凋亡的作用。如（1）NALP1：細(xì)胞凋亡蛋白Ced-4基因家族成員之一，定位與17p13，Ced家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要因子，此基因的過(guò)度表達(dá)已證實(shí)可誘發(fā)細(xì)胞凋亡13；（2

25、）IL1A、IL1B：兩者屬于IL1家族九個(gè)成員之一，他們是炎癥反應(yīng)的強(qiáng)力誘導(dǎo)因子，并且在細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡中擔(dān)當(dāng)重要角色。 任何腫瘤的發(fā)生都是一個(gè)由多基因多因素參與的多步驟、分階段的復(fù)雜過(guò)程。腫瘤發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制即包含了腫瘤發(fā)生、發(fā)展整個(gè)過(guò)程中的分子改變。在本次實(shí)驗(yàn)中，作者采用了基因水平上的篩查方法發(fā)現(xiàn)了與骨肉瘤發(fā)病密切相關(guān)的一些包括癌基因、抑癌基因在內(nèi)的腫瘤發(fā)病相關(guān)基因，這些基因與骨肉瘤發(fā)病之間關(guān)系的無(wú)疑將對(duì)作者進(jìn)一步研究骨肉瘤發(fā)病階段特異性基因改變、腫瘤發(fā)病相關(guān)基因間的相互作用等具有重要的指導(dǎo)意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Sooryanarayana V,Le H,et al.Defining

26、 aggressive prostate cancer using a 12-gene modelJ.Neoplasia，2006，8：59-68.2 Pamela L P,Matthias DH,et al.Genomic profiling of hormone-nave lymph node metastases in patients with prostate cancerJ.Neoplasia，2006，8:1083-1089. 3 Marci E S,Ben D,et al.Variation in gene expression patterns in effusions an

27、d primary tumors from serous ovarian cancer patientsJ.Mol Cancer，2005，4:26.4 曾恒,陳安民,李鋒,等.骨肉瘤誘導(dǎo)分化與多藥耐藥表型的生物學(xué)性狀比較J.中國(guó)矯形外科雜志,2007,15:1019-1022.5 Yan L,Yijun Y,et al.Common human cancer genes discovered by Integrated gene-expression analysisJ.Plos One，2007，2:1149. 6 Kornelia P. Breast cancer: origins and evolutionJ.J Clin Ivest，2007，11:3155-3163.7 Ena W, Monica C，Panelli,et al.Melanoma-restricted genesJ.J Transl Med，2004，2：34. 8 Joseph Z，Zaretsky, Itay Barnea,et al.MUC1 gene overexpressed in breast cancer: structure and transcriptional activity of the MUC1 promoter and role of estrogen re