酵母雜交技術原理及應用課件

1、酵母雜交技術原理及應用目的基因的分離目的基因的功能克隆序列克隆法篩選目的基因片段的差別雜交及減法雜交技術利用差示分析法分離目的基因克隆DNA插入誘變法分離目的基因根據生物大分子間的相互作用分離目的cDNA克隆酵母雜交技術原理及應用目的基因的功能克隆通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他蛋白分離技術分離出一定發(fā)育時期的特異蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他蛋白分離技術分離出一定發(fā)育時期的特異蛋白應用蛋白質測序技術測定特異氨基酸序列，應用蛋白質測序技術測定特異氨基酸序列，推測編碼該蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸片段作為探針推測編碼該蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸片段作為探針從從cDNA文庫或基

2、因組文庫中篩選相應的基因文庫或基因組文庫中篩選相應的基因將分離純化的特定編碼蛋白作為抗原，利用免疫動物制備抗體將分離純化的特定編碼蛋白作為抗原，利用免疫動物制備抗體用特異的蛋白質抗體篩選含有目的基因插入序列的用特異的蛋白質抗體篩選含有目的基因插入序列的cDNA表達文庫，分離出含有表達文庫，分離出含有目的基因的克隆。目的基因的克隆。酵母雜交技術原理及應用在平板上涂布涂布文庫和制備硝酸纖維濾膜的拷貝然后將濾膜處理濾膜處理（但不能在80度烘烤），暴露菌落或噬菌斑中的蛋白，在將濾膜放入含有抗體抗體的溶液中，溫育溫育一定時間后，洗去未結合的抗體洗去未結合的抗體，在加入第二抗體加入第二抗體或葡萄球菌蛋白A

3、。第二抗體是用放射性同位素或生物素或酶標記的，通過該標記找到表達產物能與抗體結合的克隆，從而篩選出目的cDNA克隆。返 回酵母雜交技術原理及應用自然界中有一些蛋白質的核苷酸編碼序列，在其進化的過程中保持著高度的保守性，這樣就使核酸的種間雜交成為可能。已知組蛋白在因、肌動蛋白基因及-神經生長因子（-nerve hrowth factor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA探針，并已成功地用于分離相關的基因。在同一蛋白質家族內，也存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段，即所謂的保守區(qū)保守區(qū)。這些保守區(qū)往往是由彼此相鄰的6-7個氨基酸組成，這樣的長度顯然適合于推導合成寡核苷酸探針庫，用來分離編

4、碼相關蛋白質的cDNA。序列克隆法根據已知基因序列或同源基因序列分離目的基因表達序列標簽法分離目的基因ESTs基因表達序列分析法返 回酵母雜交技術原理及應用利用差示分析法分離目的基因克隆mRNA差別顯示技術mRNA差別顯示技術抑制性減法雜交技術返 回酵母雙雜交酵母雜交技術原理及應用酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。 細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子反式轉錄激活因子的參與。 80年代的工作表明， 轉錄激活因子在結構上是組件式組件式的， 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成， 其中有DNA結結合結構域合結構域(DNA bindin

5、g domain， 簡稱為簡稱為BD)和轉錄激活結構域轉錄激活結構域(activation domain， 簡稱為簡稱為AD)， BD可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節(jié)的基因的上游 ；AD可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節(jié)的基因的轉錄。單獨的BD雖然能和啟動子結合， 但是不能激活轉錄。 不同轉錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能 （如酵母細胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4結合位點并激活轉錄）酵母雜交技術原理及應用如果誘餌蛋白誘餌蛋白和靶蛋白靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4

6、DNA 結合結構域和GAL4激活結構域就會相互作用，從而激活lacZ報道基因的表達。所以我們可以通過轉化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相互作用。 酵母雜交技術原理及應用1）將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質已知蛋白質Bait protein （誘餌蛋白）的基因構建在同一個表達載體上，在酵母中表達兩者的融合蛋白BD-Bait protein。2）將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構建在AD-LIBRARY表達載體上。同時將上述兩種載體轉化改造后的酵母改造后的酵母（這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產生既不能產生GAL4，又不能合成，又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因

7、此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。）3）當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因酵母基因組中的報告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。將陽性反應的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析工作。 酵母雜交技術原理及應用酵母雜交技術原理及應用酵母雜交技術原理及應用主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體； b 含DNA-activating domain的載體。這二類載體在構建融合基因

8、時， 測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內融合。融合基因在報告株中表達， 其表達產物只有定位于核內定位于核內才能驅動報告基因的轉錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad沒有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。 目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147)； LexA (E coli轉錄抑制因子)的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和皰疹病毒VP16的編碼序列等。酵

9、母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雜交技術原理及應用酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株報道株。報道株指經改造的、含報道基因含報道基因(reporter gene)的重組質粒的重組質粒的宿主細胞。 最常用的是酵母細胞酵母細胞， 酵母細胞作為報道株具有許多優(yōu)點: 1 易于轉化、便于回收擴增質粒。2具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。3酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合。 一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的明確的轉錄調控因子的DNA結合結構域(如 GAL4-bd， LexA-bd)； 另一個基因融合到轉錄激活結構域(如GAL4-ad， VP16)。激活結構域融合基因轉入表達結合結構

10、域融合基因的酵母細胞系中， 蛋白間的作用使得轉錄因子重建導致相鄰的報道基因表達(如lacZ)， 從而可分析蛋白間的結合作用。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雜交技術原理及應用 酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告基因的轉錄激活來捕獲新的蛋白質，其大致步驟為:1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結合域融合，構建成誘餌質粒誘餌質粒。2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉錄激活域融合，構建成文庫質粒文庫質粒。3、將這兩個質粒共轉化于酵母細胞中。4、酵母細胞中，已分離的DNA結合域和轉錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活

11、報告基因的轉錄；反之，則不能。利用4種報告基因的表達，便可捕捉到新的蛋白質。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雜交技術原理及應用酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內測定蛋白質的結合作用， 具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達雜合蛋白過量表達。信號測定是在自然平衡濃度條件下進行， 而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。雜交蛋白間穩(wěn)定度雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結構域激活結構域和結合結構域結合結構域結合形成轉錄起始復合物而增強， 后者又與啟動子DNA結合， 此三元復合體使其中各組分的結合趨于穩(wěn)定。通過mRNA產生多種穩(wěn)定的酶使信號

12、放大。 同時， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。 酵母雜交技術原理及應用酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點和特點 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點: 作用信號是在融合基因表達后， 在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。 檢測在活細胞內進行， 可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。 檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應， 因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫， 能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。例如已報道成功分析了

13、RAP1與RIF1ii、P21cip1與CDK2iii、p16與CDK4iv等之間的相互作用。酵母雜交技術原理及應用酵母雙雜交系統(tǒng)的應用 2、利用酵母雙雜交在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用 利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細胞的環(huán)境中研究蛋白質與蛋白質的相互作用。 而在細胞體內的抗原和抗體的聚積反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測。1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質和蛋白質的新功能當我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以

14、分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系。 另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關的主要方法。酵母雜交技術原理及應用3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互作用的影響 酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RN

15、A復制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓撲異構酶NS3，以及細胞核轉運受體BETA-importin的相互作用有關。研究人員通過酵母雙雜交技術找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復制，從而達到治療這種疾病的目的。酵母雙雜交系統(tǒng)的應用 酵母雜交技術原理及應用4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖 眾多的蛋白質之間在許多重要的生命活動中都是彼此協(xié)調和控制的。基因組中的編碼蛋白質的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術，將所有已知基因和ES

16、T序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義 酵母雙雜交系統(tǒng)的應用 酵母雜交技術原理及應用酵母雙雜交系統(tǒng)局限性和存在的問題酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的應用， 但仍存在一些局限性。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內， 而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應在核內無法進行。 另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。 酵母雙雜交系統(tǒng)的

17、一個重要的問題是假陽性。由于某些蛋白本身具有激活轉錄功能或在酵母中表達時發(fā)揮轉錄激活作用， 使DNA結合結構域雜交蛋白在無特異激活結構域的情況下可激活轉錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質的低親和力區(qū)域， 能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復合物， 從而引起報告基因的表達， 產生假陽性結果。 酵母雜交技術原理及應用酵母單雜交技術最早是從酵母雙雜交技術發(fā)展而來，酵母雙雜交技術通過對報告基因的表型進行檢測以實現(xiàn)對蛋白質間相互作用的研究，而酵母單雜交技術則通過對報告基因的表型檢測，分析DNA、蛋白之間的相互作用、蛋白之間的相互作用，以研究真核細胞內的基因表達調控。 酵母單雜交酵母單雜交在酵母雙雜交的基礎上，又發(fā)

18、展出了 酵母單雜交、酵母單雜交、酵母三雜交酵母三雜交和酵酵母的反向雜交母的反向雜交技術。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間核酸和文庫蛋白之間的研究、三種三種不同蛋白之間不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用兩種蛋白相互作用的結構和位點。酵母雜交技術原理及應用 用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉錄因子轉錄因子。研究表明GAL4 的DNA結合結構域結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)；而轉錄激活結構域轉錄激活結構域可與RNA 聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在這一過程中，DNA 結合結構域和轉錄激活結構

19、域可完全獨立地發(fā)揮作用。據此，我們可將GAL4 的DNA結合結構域置換置換為其他蛋白，只要他能與與我們想要了解的我們想要了解的目的基因目的基因相互作用，相互作用，就照樣可以通過其轉錄激活結構域激活RNA聚合酶，從而啟動對下游報告基因的轉錄。酵母單雜交系統(tǒng)的原理酵母雜交技術原理及應用正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2 部分組成：(1) 將與GAL4 轉錄激活域轉錄激活域 融合表達的cDNA 文庫質粒文庫質粒；含有目的基因目的基因和下游報告基因的報告質粒報告質粒. 首先將報告質粒報告質粒整合入酵母基因組,產生帶有目的基因的酵母報告株; 再將文庫質粒文庫質粒轉化入報告株; 若存在文庫蛋白與目的基因

20、的相互作用,可通過對報告基因的表達將文庫蛋白的基因篩選出來.酵母雜交技術原理及應用酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細胞的GAL4蛋白調節(jié)目的基因(半乳糖苷酶基因及His3基因)轉錄的特點。GAL4蛋白具有兩個可分離的功能區(qū)，N端是DNA結合結構域，C端為轉錄激活結構域。只要這兩個相對獨立的結構域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠近(如借助其他分子的相互結合使其足夠靠近)，即使它們之間沒有共價結合也可激活轉錄，這為研究蛋白質與其他分子的相互作用提供了可能。酵母三雜交的原理酵母雜交技術原理及應用酵母雜交技術原理及應用上圖顯示了酵母三雜交系統(tǒng)的原理。在酵母三雜交系統(tǒng)，lexA啟動子調

21、控下游LacZ基因和His3基因的表達，而lexA啟動子的激活取決于DNA結合結構域和轉錄激活結構域能否在空間上相互靠近。其中第一個融合蛋白第一個融合蛋白由兩部分組成，一部分為能結合lexA啟動子的DNA結合結構域，另一部分為噬菌體衣殼蛋白MS2。第二個融合蛋白第二個融合蛋白也由兩部分組成，一部分為能激活lexA啟動子的轉錄激活結構域，另一部分為有待研究的有待研究的RNA結合蛋白結合蛋白“Y”。這兩個融合蛋白通過第三個融合第三個融合的RNA分子相連，其一端為含有噬菌體衣殼蛋白MS2結合位點的MS2RNA，另一端為有待研究的有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得這個復合物形

22、成一個功能性的轉錄激活因子，從而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表達。LacZ基因的表達水平能夠通過在體外檢測半乳糖苷酶的活性來確定,His3基因的表達賦予了酵母細胞在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生存的能力。通過缺陷培養(yǎng)基及半乳糖苷酶的活性的測定就能判斷在酵母菌內是否發(fā)生了RNA“X”和蛋白質“Y”的相互作用。酵母雜交技術原理及應用 噬菌體展示技術能將表達的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體的表面，進而通過親和富集法親和富集法篩選表達有特異肽或蛋白質的噬菌體，為篩選到目的蛋白或多肽奠定了基礎。噬菌體展示技術酵母雜交技術原理及應用原理原理 噬菌體展示技術是將外源DNA 通過基因工程技術克

23、隆到適當?shù)氖删w載體上，使外源DNA 片段對應的表達產物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結構和生物活性。然后利用靶分子，采用適當?shù)奶韵捶椒ㄏ慈シ翘禺惤Y合的噬菌體，最終從噬菌體文庫中篩選出能結合靶分子的目的噬菌體；外源多肽或蛋白質表達在噬菌體的表面,而其編碼基因作為噬菌體基因組中的一部分可通過噬菌體DNA 序列測序出來。 該技術的顯著特點是建立了基因型和表現(xiàn)型之間的對應關系。酵母雜交技術原理及應用類型 1 絲狀噬菌體展示系統(tǒng) 絲狀噬菌體屬于單鏈環(huán)狀DNA 病毒，編碼10種蛋白質，其中與噬菌體展示有關的是p 和p 衣殼蛋白。p 蛋白蛋白位于

24、噬菌體顆粒的一端，有3 個5 個拷貝，可在N 端、近N 端或N 端與C 端的柔性連接區(qū)融合外源肽或蛋白質。p 蛋白對展示的外源多肽或蛋白質的大小無嚴格限制，但由于p 蛋白的拷貝數(shù)只有3 個5 個，在免疫學和生物疫苗研制中受到了限制。p 蛋白位于噬菌體顆粒的兩側，一般在N 端或近N 端融合外源序列。由于p 分子較小，只能融合較小的外源肽段，攜帶肽段太大會影響外殼的組裝，使其失去感染力。但它的拷貝數(shù)多，因此該系統(tǒng)一般用于篩選親和力較低的配體，高拷貝p 蛋白在疫苗開發(fā)上具有潛在的應用價值。酵母雜交技術原理及應用2 噬菌體展示系統(tǒng) 噬菌體是最早使用的克隆載體，其兩端為不閉合的線形雙鏈DNA，末端為長1

25、2 個核苷酸的互補單鏈。 噬菌體展示系統(tǒng)是將外源序列插入噬菌體頭部組裝必需的D 蛋白的蛋白的N 端或端或C 端，端，或主要尾部蛋白主要尾部蛋白PV 的羧基端折疊區(qū)的羧基端折疊區(qū)(非功能區(qū)) ，實現(xiàn)外源蛋白的表面展示。噬菌體是在宿主細胞內完成裝配的，無需將外源肽或蛋白分泌到細菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白(100 ku 以上蛋白) 及對宿主細胞有毒性的蛋白，適用范圍極廣。酵母雜交技術原理及應用3 T4 噬菌體展示系統(tǒng)T4 噬菌體展示系統(tǒng)是將外源肽/ 蛋白質與T4噬菌體的小外衣殼蛋白C 端融合而被展示，展示方法是利用一個選擇性載體(或稱之為整合載體)，將融合有外源序列的小外衣殼蛋白( small outer capsidprotein ,SOC) 融合基因同源整合入缺失SOC 的T4 基因組中，選擇恢復溶菌酶生長不依賴性的噬菌體，即可將外源肽/ 蛋白質展示于噬菌體表面。SOC具有與噬菌體顆粒表面專一結合的能力，因此還可用體外組裝的方法實現(xiàn)展示。方法是將SOC 及其融合