原位雜交原理及具體操作

1、原位雜交實(shí)驗原理與方法一、目的本實(shí)驗的目的是學(xué)會原位雜交的使用方法。了解各種原位雜交的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。二、原理原位雜交組化（簡稱原位雜交， in situ hybridizationhistochemistry； ISHH）屬于分子雜交的一種， 是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術(shù)。原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下， 使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。當(dāng)然雜交分子的形成并

2、不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。探針的種類按所帶標(biāo)記物可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類。目前，大多數(shù)放射性標(biāo)記法是通過酶促反應(yīng)將標(biāo)記的基因摻入DNA中，常用的同位素標(biāo)記物有3H、 35S、125I 和 32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高，背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)， 但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害， 近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、 cRNA探針和合成寡核苷酸探針。cD

3、NA探針又可分為雙鏈 cDNA探針和單鏈 cDNA探針。原位雜交又可分為菌落原位雜交和組織原位雜交。菌落原位雜交（ Colony in situ hybridization）菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上， 然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將 NDA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。組織原位雜交（ Tissue in situ hybridization）組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增

4、加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或 RNA雜交。（一）探針的選擇根據(jù)不同的雜交實(shí)驗要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或 cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如， 在檢測靶序列上的單個堿基改變時應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針 （通過克隆人M13噬菌體 DNA獲得）或 RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交， 因為它不易透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下， 寡核苷酸探針和短的 PCR標(biāo)記探針（ 80

5、150bp）具有較大的優(yōu)越性。在選用探針時經(jīng)常會受到可利用探針種類的限制。如在建立 DNA文庫時， 手頭沒有篩選特定基因的克隆探針， 這時就可用寡核苷酸探針來代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測定 6 個以上的末端氨基酸序列， 通過反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探針。如果已有其它動物的同種基因克隆，因為人類和動物間在同一基因的核苷酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動物基因作探針來篩選人類基因克隆。對于基因核苷酸序列背景清楚而無法獲得克隆探針時， 可采用 PCR方法擴(kuò)增某段基因序列，并克隆人合適的質(zhì)粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡便，無論基因組DNA探針還是cDNA

6、探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測方法，與探針雜交方法可作對比，可謂一舉兩得。（二）探針的標(biāo)記方法在選擇探針類型的同時，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時，還應(yīng)考慮實(shí)驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。 一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實(shí)際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。（三）探針的濃度

7、總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。 依我們的經(jīng)驗， 要獲得較滿意的敏感性， 膜雜交中 32P 標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為 5 10 ng/ml 和 251000ng/ml ，而原位雜交中， 無論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為 0.5 5.0 g/ml 。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。（四）雜交率在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復(fù)雜度）和探針濃度。（五）雜交最適溫度雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 1015，堿基順序

8、高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對減少， 錯配對增多、 氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在 50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10 倍，因此在實(shí)驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即最適復(fù)性溫度、 苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3 。最適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）： Tor =Tm 25苛刻復(fù)性溫度： Ts = Tm （10 或 15）非苛刻復(fù)性溫度： Tns =Tm

9、 （ 30 或 35）（六）雜交的嚴(yán)格性影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體?（七）雜交反應(yīng)時間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益， 會引起非特異結(jié)合增多。 一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h 左右。 1966 年 Britten和 Kohne 推薦用 Cot =值來計算雜交反應(yīng)時間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（ Co）和 反應(yīng)時間（ t ）的乘積。實(shí)驗表明Cot =100 時，雜交反應(yīng)基本完成。 Cot=0 ，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的 DNA400g/ml （按單股 DNA每微克 紫外

10、吸收值為 0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時間為21h，那么對于未標(biāo)記的 DNA來說，Cot =9.6/21=100.8, 雜交完成了。對標(biāo)記DN A（濃度為0.1 g/ml ）來說 Cot 值為 0.05 ，這就充分排除了標(biāo)記 DNA的自我復(fù)性。Tm 值 25時雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見， 通過調(diào)節(jié) 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。（八）雜交促進(jìn)劑惰性多聚體可用來促進(jìn)250 個堿基以上的探針的雜交率。 對單鏈探針可增加3 倍，而對雙鏈探針、 隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100 倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度

11、低和分子量小，短探針本身的雜交率就高。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進(jìn)劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?6000 8000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5% 10%硫酸葡聚糖效果較好，若用 5% 10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2% 4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價格低廉，粘度低（ MW=90 000）。小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的

12、能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到， 該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn) RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制DNA的RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進(jìn)劑。（七）雜交反應(yīng)時間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h 左右。 1966 年 Britten和 Kohne

13、 推薦用 Cot =值來計算雜交反應(yīng)時間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（ Co）和 反應(yīng)時間（ t ）的乘積。實(shí)驗表明Cot =100 時，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0 ，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的 DNA400g/ml （按單股 DNA每微克 紫外吸收值為 0.024 計算，總的吸收值為 9.6 ），如果反應(yīng)時間為 21h，那么對于未標(biāo)記的 DNA來說，Cot =9.6/21=100.8,雜交完成了。對標(biāo)記DN A（濃度為 0.1 g/ml ）來說 Cot 值為 0.05 ，這就充分排除了標(biāo)記 DNA的自我復(fù)性。Tm 值 25時雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜

14、交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。（八）雜交促進(jìn)劑惰性多聚體可用來促進(jìn)250 個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3 倍，而對雙鏈探針、 隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100 倍。而短探針不需用促進(jìn)劑， 因其復(fù)雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進(jìn)劑是聚乙二醇（PEG）， PEG分子量?。?6000 8000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5% 10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5% 10%PE

15、G則可產(chǎn)生很高的本底。因此， 使用促進(jìn)劑時有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2% 4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價格低廉，粘度低（MW=90 000）。小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。 酚作為雜交促進(jìn)劑， 只能在低 DNA濃度的液相雜交中觀察到， 該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的 Tm值而起作用。此外， 該分子還可以促進(jìn)RNA的雜交， 有裂解細(xì)胞而抑制RNase的

16、作用。 總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進(jìn)劑。三、主要器材醫(yī)用微波爐，恒溫水浴箱、濕盒、PNP筆等。四、試劑（二）試劑 : 2.5ml/L 的醋酸 2.5ml/L 醋酸酐 :三乙醇胺13.2ml氯化鈉 5g濃鹽酸 4ml醋酸酐（用前加）2.5ml ； 20×SSC（ pH7.0 ）：氯化鈉 175.3g枸櫞酸鈉88.2g雙蒸水定容至1L； 100×Denhardt s: Ficoll 1gPVP 1g BSA 1gddH2O 定容至 50ml； 雜交液：（ 50ml） 用量 終濃度100%去離子甲酰胺25ml 50%100%葡聚糖硫酸脂5mg

17、10%100×Denhards 0.5ml 11Mtris-HCL （ PH8.0） 0.5ml 10Mm5M NaCl 3ml 0.3M0.5M EDTA （ PH8.0） 0.1ml 1mM10mg/ml 變性魚精DNA 0.5ml 100ug/mlddH2O定容至 25ml 0.1M 甘氨酸 /PBS:甘氨酸 7.5gNa2HPO4 30.8gNaH2PO4 2.8gNaCl 8.5g溶于 800mlddH2O，定容至1000ml，高壓，室溫儲存；TSM1（ 1000ml ）：1MTris-HCL （ PH8.0） 100ml5M NaCl 20ml1M MgCl2 10mld

18、dH2O定容至 1000ml ；TSM2（ 1000ml ）：1MTris-HCL （ PH8.0） 100ml5M NaCl 20ml1M MgCl2 50mlddH2O定容至 1000ml ；抗體稀釋液：100mlBSA 1.0gTris X-100 0.4ml疊氮鈉 0.4g0.05M PBS （ PH7.2）調(diào)至 100ml； 0.05M PBS （ PH7.2）： 1000ml Na2HPO4 15.4gNaH2PO4 1.4g NaCl 4.25g去內(nèi)源性酶液（40ml）：儲存液用量終濃度10%甲醛 4.0ml 0.3 0.5%冰醋酸 10.0ml 25.0%加 0.05MPBS至

19、 40ml 0.4% Triton-X 100五、操作（一）脫蠟，水化：1、二甲苯 10min 兩次2、 無水乙醇 3min 兩次、 95%乙醇 3min 一次、 75%乙醇 3min 一次、 50%乙醇 2min 一次、重蒸水2min 一次、 PBS洗滌 5min（二）將組織芯片放入去內(nèi)源性酶液中浸泡30min ； PBS洗滌 5min（三）0.1M 甘氨酸去游離醛基 15min ；0.4%tritonX-100洗 10min；（四）用蛋白酶 K 與 37孵育 30min ， PBS振洗 5min（五）在 0.1mol/L 三乙醇胺 0.25%乙酸酐中孵育10min ; 在 2×S

20、SC中洗 5min ；（六）滴加預(yù)雜交液42,30min ；將 RNA探針用預(yù)雜交液稀釋（1ng/ L2ng/ L）（七）雜交、在載玻片表面覆蓋上雜交小室，加 2050 L 的雜交液到組織芯片TMA上，4244濕盒中過夜。、在4×SSC中 37洗滌 15min、 2×SSC，加入 RNA酶（大致為10 g/ml ）37中洗滌 30min，、 0.5 ×SSC,37洗滌15min（八）封閉、 1%正常山羊血清孵育30min、用抗體稀釋液稀釋堿磷酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（1： 500）37中孵育 3h， PBS洗三次，每次 5min、 TSM1洗；、 TSM2洗；（九）顯

21、色：用TSM2將 NBT/BCIP 按 2： 1 稀釋進(jìn)行顯色；顯微鏡下掌握染色程度（十）終止顯色：用水終止（十一）脫水，透明，封固、 85%乙醇脫水， 2min、 95%乙醇脫水5min、無水乙醇脫水15min、二甲苯20min、封片，鏡檢原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法點(diǎn)擊次數(shù)： 236 發(fā)布時間： 2010-2-1 8:13:09一、核酸分子雜交技術(shù)1961 年 Hall開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。自此以后， 由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是 70 年代末到80 年代初，

22、 分子克隆、 質(zhì)粒和噬菌體 DNA的構(gòu)建成功， 核酸自動合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現(xiàn)。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交有菌落原位雜交（colony in situhybridization）、斑點(diǎn)雜交法 （ Dot blot ）、Southern 印跡雜交（Southern blot）、Northern印跡雜交（ Northern

23、blot）和組織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等。二、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（In situ hybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交系細(xì)菌裂解釋放出DNA，然后進(jìn)行雜交。Southern 印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的RN

24、A片段的。它們都只能證明該病原體、 細(xì)胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。1969 年美國耶魯大學(xué)Gall和 Pardue 首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時，BuongiornoNardelli和Amaldi, John及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。 Orth （1970 ）應(yīng)用 3H 標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒 cRNA 探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交， 首次用原位雜交檢測了病毒 DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時的工作多采用冰凍組織切

25、片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交。Bauman（ 1981）等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記 cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer （1982）報道用 2，4 二硝基苯甲醛（ DNP）標(biāo)記 DNA探針，使該 DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。Pezzella （ 1987）創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來做細(xì)胞或組

26、織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對雜交結(jié)合的探針進(jìn)行定位。 本法的優(yōu)點(diǎn)是磺基化DAN探針標(biāo)記簡便， 不需作缺口平移標(biāo)記，敏感度也較高。 但自生物素和高辛標(biāo)記探針技術(shù)建立后，已有取而代之的趨勢。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是 Brigat （ 1983）首先建立的， 它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶- 抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。 生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。這種生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶

27、促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)，該技術(shù)是用光敏生物素（ Photobiotin ）標(biāo)記核酸。目前應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補(bǔ)骨脂素生物素，它們都是由三個部分組成：光敏基團(tuán)、連結(jié)臂和生物素（圖20-1 ）。在強(qiáng)光下，不需酶反應(yīng)， 光敏生物素的光敏基團(tuán)即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100 150 個堿基才能標(biāo)記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度（Forster et al1985）。近年來，地高辛（Digoxigonin）標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。Boeringer

28、MannhemBio chemisca 于 1987 年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場。和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時間。 同時在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。 地高辛標(biāo)記法顯示的顏色為紫藍(lán)色（標(biāo)記堿性磷酸酶- 抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)），有較好的反差背景。核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為DNA探針、 RNA探針、 cDNA探針、 cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈 DNA（ Single stranded, ssDNA）和雙鏈D

29、NA（ Double stranded, dsDNA）之分（詳見十九章）。早期應(yīng)用的主要是DNA探針，繼之Temin 在 70 年代研究致癌RNA病毒時制備了 cDNA探針（ complementary DNA ），其基本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）又稱為RNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。 CDNA是指互補(bǔ)于 mRNA的 DNA分子。RNA探針是將特異性的 cDNA 片段插入含有相當(dāng)?shù)?RNA聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄性載體。 這類載體包括 pSP6

30、4和 pSP65，它們具有不同的啟動子在多克隆位點(diǎn)的各側(cè)。Psp64 和 pSP65在 sP6 啟動子的多克隆位點(diǎn)的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制 RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄 RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（ Sense probe ）和與 mRNA互補(bǔ)的反義 RNA探針（antisense probe ），又稱互補(bǔ)RNA探針（ complementary RNA probe , cRNA ）。通常用同義 RNA探針做為反義 RNA探針的陰性對照。 由于 RNA探針是單鏈分子， 所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。有

31、報告認(rèn)為其雜交率高于DNA探針的 8 倍。 DNA 合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由 DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便， 價格低廉的優(yōu)點(diǎn)， 也可進(jìn)行放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不如克隆性探針強(qiáng)，亦不如其雜交信號高。原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在近20 年的發(fā)展可以說是飛躍的，其突出的特點(diǎn)是由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加，探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了，更重要的是非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在不久的將來將和現(xiàn)今的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一樣成為實(shí)驗室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。新的非放射性

32、標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。Coulton （ 1991）建議將非放射性標(biāo)記技術(shù)更名為親合復(fù)合物標(biāo)記技術(shù)（ Affinity ComplexLabelledProbes,ACLP ）。因為“非（non ）“在英文里是一個否定的名詞，而且根據(jù)非放射性標(biāo)記技術(shù)的原理是將一個標(biāo)記物利用其親合性，應(yīng)用直接或間接的方法結(jié)合在核苷酸分子上。原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項革命性的技術(shù)。它使它們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。為各個學(xué)科的研究帶來突破性的進(jìn)展。其中特別突出的是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。我們在下節(jié)將詳加敘述。三、位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本方法

33、如前所述， 由于核酸探針的種類和標(biāo)記物的不同，在具體應(yīng)用的技術(shù)方法上也各有差異，但其基本方法和應(yīng)用原則大致相同。大致可分為：雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；雜交；雜交后處理；顯示（visual ization ）：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。a）固定原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（In SituHybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或 RNA的水平； 使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的， mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶

34、合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說， 固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH 的結(jié)果時應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織。其它如醋酸- 酒精的混合液和 Bouin s 固定劑也能獲得較滿意的效果。對于 mRNA的定位

35、，我們常采用的方法是將組織固定于 4%多聚甲醛磷酸緩沖液中 1 2h，在冷凍前浸入 15%蔗糖溶液中，置 4冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在- 70。 如冰箱溫度恒定， 在 - 70可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對檢測DNA和 mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定

36、干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點(diǎn)，如沉淀性 （ Precipitating）固定劑：酒精 / 醋酸混合液、 Bouin s 液、 Carnoys 液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認(rèn)為ISHH 較為理想的固定劑。b）玻片和組織切片的處理1玻片的處理玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡 24h，清水洗凈烘干， 95%酒精中浸泡 24h 后蒸餾水沖洗、

37、烘干，烘箱溫度最好在 150 或以上過夜以去除任何 RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放由于 ISHH的實(shí)驗周期長，實(shí)驗程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應(yīng)用，以保證在整個實(shí)驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬 - 明膠液，其優(yōu)點(diǎn)是價廉易得， 但在長周期實(shí)驗過程中， 粘附效果不夠理想。 多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進(jìn)口。2增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強(qiáng)的增強(qiáng)組織通透性的試劑。增強(qiáng)組

38、織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（ detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、 膠原蛋白酶和淀粉酶 （diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號， 但同時也會減低RNA的保存最和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應(yīng)慎為掌握。蛋白酶K（ Proteinase K）的消化作用在 ISHH 中是應(yīng)用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度及孵育時間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用酶K1g/ml （于 0.1mol/L Tris/50mmol/L EDTA, pH8.

39、0緩沖液中） ,37 孵育 1520min ，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶 K 還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶K 消化后，應(yīng)用 0.1mol/L 的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K 的消化作用，甘氨酸是蛋白酶 K 的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用 4%多聚甲醛再固定。 Burns 等（ 1987）報告應(yīng)用胃蛋白酶（ Pepsin ） 20100g/ml （用 0.1N HCl 配） 37、 30min 進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗結(jié)果優(yōu)于蛋白酶 K。不少實(shí)驗工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（ acetic anhydride

40、）和三乙醇胺（ tri ethanolamine ）中以減低靜電效應(yīng)， 減少探針對組織的非特異性背景染色。 有的作者除在室溫下浸于上述溶液 10min 外，還在預(yù)熱 37的 50%甲酰胺 /2 ×SSC 液中預(yù)雜交 15min，然后用 2×SSC， 0.30mol/L NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min 。但Heinz 、Hofer等一些著名學(xué)者卻對此持有異議，根據(jù)他們的實(shí)驗和經(jīng)驗證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH 的信 / 噪比例。3減低背景染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色一樣ISHH實(shí)驗程序中， 如何減低背景染色是一個重要

41、的問題。 ISHH 中背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。預(yù)雜交 （Prehybridization ）是減低背景染色的一種有效手段。 預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（ Dextran sulphate ）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。有的實(shí)驗室在雜交后洗滌中采用低濃度的 RNA酶溶液 （20g/ml ）洗滌一次， 以減低殘留的和內(nèi)源性的 RNA酶，減低背景染色。4防止 RNA酶的污染由于在手指皮膚及實(shí)驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污

42、染影響實(shí)驗結(jié)果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗前一日置高溫（ 240）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在 150左右。 有條件的國外實(shí)驗室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出時空氣污染。在無高溫消毒的烤箱時， 亦可用國內(nèi)出產(chǎn)的衛(wèi)生蒸汽消毒鍋（山東新華醫(yī)療器材廠生產(chǎn)）。雜交前及雜交時所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。c）雜交（ Hybridisation）在 ISHH，整個實(shí)驗周期是比較長的，實(shí)驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH 整個實(shí)驗中可被認(rèn)為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交

43、這一步驟中核酸探針能進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，雜交是ISHH 中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內(nèi)向正華等采用無菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片也可獲得滿意的實(shí)驗結(jié)果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。因此，也有為穩(wěn)妥起見，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認(rèn)為這并不十分必要， 因封固的石蠟在高溫下融解反易導(dǎo)致雜交液的污染，必要時可加橡皮泥封固蓋片四周。 硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無雜質(zhì)，光滑不會產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸， 蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。在孵育

44、時間較長時， 為保證雜交所需的濕潤環(huán)境，可將復(fù)有硅化蓋玻片進(jìn)行雜交的載片放在盛有少量 5×SSC或 2×SSC（ standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞） 中進(jìn)行孵育。 雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。如前所述， 雜交前的準(zhǔn)備只是為雜交的成功奠定基礎(chǔ)，要獲得滿意的實(shí)驗結(jié)果，在雜交這一實(shí)驗過程中還須注意以下的環(huán)節(jié)。1探針的濃度很難事先確定每一種實(shí)驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實(shí)驗最大的信 / 噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關(guān)。根據(jù)國內(nèi)外實(shí)驗工作者的經(jīng)驗，

45、 認(rèn)為最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。這和我們在免疫細(xì)胞化學(xué)試驗中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。探針濃度依其種類和實(shí)驗需要略有不同， 根據(jù)筆者的經(jīng)驗及所查閱文獻(xiàn)， 在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中，探針濃度為 0.5 5.0 g/ml （即 0.5 5.0ng/ l ）。根據(jù) Heinz 、 Hofelt 實(shí)驗室經(jīng)驗，對放射性標(biāo)記的 dsDNA或 cRNA探針，其濃度在 25ng/ l 。 Conlton 認(rèn)為生物素標(biāo)記探針，其最佳濃度在 0.5 5ng/ l 。作者在英皇家研究生院 Polak 教授實(shí)驗室應(yīng)用于放射性標(biāo)記 cRNA探針的濃度為 0.5ng/ l

46、，而在非放射性標(biāo)記 （生物素或地高辛） cRNA 探針濃度為 2.5ng/ l ，放射性標(biāo)記DNA探針濃度為1.0ng/ l 。向正華等應(yīng)用地高辛標(biāo)記生長抑素 cRNA探針獲得滿意結(jié)果，其探針濃度為0.5ng/ l 。必須強(qiáng)調(diào)的是，國內(nèi)外實(shí)驗室都證明加雜交液的量要適當(dāng)，以雜交液過多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落，交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。1020l/ 每張切片為宜。影響雜交效果， 過量的雜2探針的長度 一般應(yīng)用于 ISHH探針的最佳長度應(yīng)在 50100 個堿基之間。 探針短易進(jìn)入細(xì)胞， 雜交率高， 雜交時間短。 據(jù)報告， 長 500 個堿基的探針，

47、其雜交時間約需 20h 左右。200 500 個堿基的探針仍可應(yīng)用，如超過 500 個堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn)行水解，使其變成短的片段，達(dá)到實(shí)驗所需求的堿基數(shù)。3雜交的溫度和時間雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環(huán)節(jié)。在第十八章概述中曾提到 DNA或 RNA需加熱或變性、解鏈后才能進(jìn)行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度， 叫解鏈溫度或融解溫度（ melting temperature,簡稱 Tm）。原位雜交中， 多數(shù) DNA探針需要的 Tm是 90，而 RNA則需要 95。這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規(guī)的加入3

48、0% 50%甲酰胺（ for mamide）于雜交液中。 McConaughy報告，反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度， Tm值可降低0.72 。因此，可用調(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來調(diào)節(jié)Tm。 Tm的計算公式在第十九章有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長度、 甲酰胺的百分比等諸多因素有關(guān)。由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素， 實(shí)際采用的原位雜交的溫度在Tm-25左右， 即比 Tm減低 25，大約在3060之間，根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在3742左右，而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的，則必須在8095加熱使其變性，時間 5 15min，（有作用報告在迅速冷卻

49、，以防復(fù)性，再置入盛有105微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之2×SSC的溫盒內(nèi)，在3742孵育雜交過夜。雜交的時間如過短會造成雜交不完全， 而過長則會增加非特異性染色。 從理論上講， 核苷酸雜交的有效反應(yīng)時間在 3h 左右。 Barns 等（ 1987）報告用 DNA探針雜交，其反應(yīng)完成時間為 2 4h。但為穩(wěn)妥起見， 一般將雜交反應(yīng)時間定為 16 20h，或為簡便起見雜交孵育過夜，從現(xiàn)有文獻(xiàn)報告看無不良結(jié)果。當(dāng)然，雜交反應(yīng)的時間與核酸探針長度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反應(yīng)時間應(yīng)予考慮， 并經(jīng)反復(fù)實(shí)驗確定。 有作者主張雜交反應(yīng)的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，因為光線會促進(jìn)甲酰胺的電離作用。4雜交嚴(yán)格度（ Hybridization stringency）雜交條件的嚴(yán)格度（stringency ）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對（ mismatch ）雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。一般來說，低嚴(yán)格度（l