比濁法快速測定硫酸多黏菌素E效價

1、比濁法快速測定硫酸多黏菌素E效價(1)        作者：佟斌 吳兆亮 殷昊 趙艷麗 【摘要】 研究比濁法測定硫酸多黏菌素E效價的影響因素和規(guī)律，建立了硫酸多黏菌素E的比濁法快速測定方法，檢測時間由杯碟法的20h縮短到4h。當(dāng)硫酸多黏菌素E的效價為30100u/ml時，檢測菌液接種濃度為5%，培養(yǎng)時間為4h，吸光度對數(shù)值與抗生素效價具有良好的線性關(guān)系。本法重現(xiàn)性好，相對誤差小于5%。 【關(guān)鍵詞】 硫酸多黏菌素E 比濁法 效價    Fast determination of

2、 the potency of polymyxin E by turbidimetry assay    ABSTRACT A turbidimetry assay for fast determination of polymyxin E potency was developed by studying on the influencing factors. Compared with Oxford assay, turbidimetry assay decreased the determination time from 20 hours to

3、4 hours. There was a linear relationship between the potency of polymyxin E and the logarithm of absorbency in the range of 30100u/ml and inoculating concentration was 5%, with 4hour culture time. The turbidimetry assay had a good reproducibility, and the relative error was less than 5%.  

4、  KEY WORDS Polymyxin E; Turbidimetry assay; Potency    多黏菌素E(polymyxin E或colistin)是由多黏芽孢桿菌抗敵素變株(Bacillus polymyxin var.colistinus)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的一種環(huán)狀多肽類抗生素，它對革蘭陰性桿菌有強烈的抑菌作用1。由于多黏菌素E具有高效、低毒、殘留少的特性，將其硫酸鹽制成獸藥用于防治由大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌等革蘭陰性菌2引起的肉雞、豬、牛等畜禽的腸道疾病。目前采用杯碟法3，4測定其生物效價。杯碟法操作步驟

5、復(fù)雜，耗時長，測定時間需要大約20h，不能快速反饋工業(yè)生產(chǎn)中各個階段產(chǎn)品生物活性，必須開發(fā)一種快速測定硫酸多黏菌素E效價的方法。比濁法是抗生素效價微生物檢定的方法之一58，其原理是將一定量的抗生素加至接種有試驗微生物的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后，經(jīng)短期培養(yǎng)，測量培養(yǎng)物的吸光度，在一定線性范圍內(nèi)細(xì)菌培養(yǎng)物吸光度的對數(shù)值logA與抗生素的濃度成正比，比濁法具有檢測快速的特點。本文深入研究了比濁法測定硫酸多黏菌素E效價的影響因素和規(guī)律，建立了硫酸多黏菌素E的比濁法快速檢測方法。    1 材料與方法    1.1 材料

6、0;   (1)檢定菌 大腸埃希菌(CMCC(B)44102)購自微生物菌種保藏中心。    (2)硫酸黏桿菌E素(硫酸多黏菌素E)標(biāo)準(zhǔn)品 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)查所提供，批號K02700902，效價19536u/mg。    (3)主要儀器 752紫外分光光度計；恒溫水浴振蕩器；牛津杯(不銹鋼，高100mm，外徑8.0mm，內(nèi)徑6.0mm)；PHS3C精密pH計。    1.2 方法    (1)檢定培養(yǎng)基的制備

7、 稱取蛋白胨8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氫二鉀3.3g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉4.5g，葡萄糖2.5g，加蒸餾水至1000ml加熱混勻，調(diào)節(jié)pH值為7.2，過濾，115滅菌30min。    (2)檢測菌液的制備 取大腸埃希菌的瓊脂斜面培養(yǎng)物一支，加0.9%滅菌生理鹽水1ml洗下菌苔轉(zhuǎn)入茄瓶，37培養(yǎng)1822h，用0.9%滅菌生理鹽水15ml洗下菌苔，制成菌液，在分光光度計上波長為600nm處用0.9%滅菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以2.5%、5%和10%的接種量接種至檢定培養(yǎng)基作為檢測菌液。  

8、0; (3)硫酸多黏菌素E標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取硫酸多黏菌素E標(biāo)準(zhǔn)品，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋到600u/ml，再用水稀釋成濃度分別為30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。    (4)比濁法吸光度測定 精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml檢測菌液，放入恒溫水浴搖床以200r/min轉(zhuǎn)速37振蕩培養(yǎng)一定時間，取出，立即用冷水冷卻，搖勻，以9ml未接種檢定培養(yǎng)基和1ml水混合液作參比，用分光光度計在600nm波長處9分別測定吸光度。    (5)比濁法樣

9、品檢測 將樣品稀釋到適當(dāng)濃度后，按實驗1.2.(4)中有關(guān)步驟操作測定吸光度，在吸光度對數(shù)效價標(biāo)準(zhǔn)曲線上查對應(yīng)的效價，乘以稀釋倍數(shù)，即得到樣品的效價。    2 結(jié)果與討論    2.1 檢測條件的選擇    (1)大腸埃希菌生長曲線的測定 將大腸埃希菌菌液分別以2.5%、5.0%和10%的接種量接入檢定培養(yǎng)基，37條件下以200r/min振蕩培養(yǎng)，在600nm處每小時檢測一次培養(yǎng)物的吸光度，結(jié)果如Fig.1所示。大腸埃希菌在自然狀態(tài)下生長時延遲期一般為1h左右，這一時期菌體

10、生長緩慢，菌量基本上維持在最低水平；然后進入指數(shù)期，這一時期大約持續(xù)78h，這一時期菌體生長速率常數(shù)最大，生長最迅速；9h以后進入穩(wěn)定期，菌體總量保持不變。當(dāng)菌體生長時間在24h，吸光度值達(dá)到0.41.0，處于最佳檢測時期。    Innoculating concentration: 1: 2.5%; 2: 5%; 3: 10%    Fig.1    Cell growth curve of E.coli    (2)檢測菌液接種濃

11、度的選擇 將接種濃度分別為2.5%、5.0%和10%的檢測菌液按實驗1.2.(4)培養(yǎng)2h，繪制吸光度效價曲線(Fig.2)。 由Fig.2可見，不同接種濃度的檢測菌液對培養(yǎng)物的吸光度影響較大。當(dāng)檢測菌液接種濃度為2.5%時，由于初始接種量少，少量抗生素的存在能夠完全抑制菌體的生長，菌體幾乎不能生長；當(dāng)檢測菌液接種濃度為10%時，菌體生長很快，抗生素難以抑制菌體生長，不同濃度抗生素對菌體生長的抑制程度不明顯；當(dāng)檢測菌液接種濃度為5%時，不同濃度抗生素對菌體生長的抑制程度區(qū)別明顯，靈敏度高，因此5%接種濃度的檢測菌液適合本法測定硫酸多黏菌素E效價。    

12、Innoculating concentration: 1: 2.5%; 2: 5%; 3: 10%    Fig.2    Effect of different innoculating concentration    on absorbency    (3)培養(yǎng)時間的選擇 接種濃度5.0%的檢測菌液，按實驗1.2.(4)分別培養(yǎng)2、3和4h，繪制吸光度效價曲線(Fig.3)。由Fig.3可見，在實驗菌接種量固定在5%的條件下，增

13、加培養(yǎng)時間，靈敏度提高顯著。培養(yǎng)時間為2h，吸光度效價曲線比較平坦，靈敏度低，當(dāng)培養(yǎng)時間增加為4h，不同濃度抗生素對菌體生長的抑制程度區(qū)別明顯，靈敏度高，因此選擇4h作為培養(yǎng)時間用于檢測。 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不要用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。        2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立    精密吸取30、40、50、60、70、80、90和100

14、u/ml等8種硫酸多黏菌素E標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml，加9ml接種濃度為5%的檢測菌液，放入恒溫水浴搖床以轉(zhuǎn)速200r/min 37培養(yǎng)4h，取出，立即用冷水冷卻，搖勻，以9ml未接種檢定培養(yǎng)基和1ml水混合液作參比，用分光光度計在600nm波長處分別測定吸光度，以硫酸多黏菌素E濃度為橫坐標(biāo)，吸光度對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Fig.4)。    將吸光度對數(shù)值對相應(yīng)濃度進行線性回歸，得到回歸方程：    lgA=-0.01039C 0.1837 r=0.9953    可見硫酸多

15、黏菌素E的濃度在30100u/ml的范圍內(nèi)與吸光度對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。    2.3 重現(xiàn)性測定    用比濁法對3個不同規(guī)格的硫酸多黏菌素E樣品進行重現(xiàn)性試驗，檢測4次結(jié)果見Tab.1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%以內(nèi)，重現(xiàn)性較好。    2.4 正確性測定    以杯碟法10測定效價數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，得出本方法的準(zhǔn)確度(Tab.2)；比濁法測定的相對誤差在5%以內(nèi)，符合藥典規(guī)定要求，提示比濁法能夠準(zhǔn)確測定硫酸多黏菌素E效價。 

16、0;  3 結(jié)論    (1)比濁法能夠快速、準(zhǔn)確地測定硫酸多黏菌素E效價，檢測時間由杯碟法的20h縮短到4h，方法重現(xiàn)性好，相對誤差小于5%。    (2)比濁法進行硫酸多黏菌素E效價測定時應(yīng)注意培養(yǎng)基的質(zhì)量以及檢測儀器等。培養(yǎng)基配置后應(yīng)過濾后再滅菌，以免培養(yǎng)基中形成沉淀影響測量。試管應(yīng)選同一批、同一型號，管壁均勻一致，試管潔凈無污染，以免影響測量結(jié)果。培養(yǎng)結(jié)束后立即冷卻，測定前應(yīng)搖勻?！緟⒖嘉墨I】1 Starkey D D, Antoinette I, Ralph J W. Paradoxi

17、cal synergism and antagonism between serum and antibacterial activity of colistin J. J Infect Dis,1971,23(4):3922 Jian L, Roger L N, Robert W M, et al. Evaluation of colistin as an agent against multiresistant Gramnegative bacteria J. Int J Antimicrob Agents,2005,(25):113 吳佩玲. 改進硫酸粘桿菌素含量測定方法的介紹J. 中國獸藥雜志，1990，3：224 張純平，肖希龍. 硫酸粘桿菌素微生物檢定法的改進J. 中國獸藥雜志，2002，36(4)：33 5 楊亞莉, 胡昌勤. 中國藥典2005年版微生物檢定法的增修訂情況及要點J. 中國抗生素雜志，2005，30(12)：7076 The European Pharmacopoei