HPLC測(cè)定復(fù)方丹參方中丹參三種水溶性成分的含量

1、HPLC測(cè)定復(fù)方丹參方中丹參三種水溶性成分的含量潘桂湘1，張伯禮2，喬延江1（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100102；2.天津中醫(yī)學(xué)院，天津300193）摘要 目的：建立復(fù)方丹參方中丹參水溶性成分的含量測(cè)定方法，初步探討丹參與三七配伍后的變化規(guī)律。方法：采用高效液相色譜法，分別以甲醇-乙腈-0.5%醋酸（2.5：3.5：94）為流動(dòng)相，于281nm處檢測(cè)丹參素和原兒茶醛，以乙腈-0.5%醋酸（20：80）為流動(dòng)相，于253nm處檢測(cè)丹酚酸B。結(jié)果：丹參素進(jìn)樣量在0.316.2g范圍時(shí)，相關(guān)系數(shù)r = 0.9991；原兒茶醛進(jìn)樣量在5.6112ng范圍時(shí)，相關(guān)系數(shù)r = 0.9996；丹酚酸B進(jìn)

2、樣量在0.34.5g范圍時(shí)，相關(guān)系數(shù)r = 0.9998。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為復(fù)方丹參方中水溶性成分的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)鍵詞 復(fù)方丹參方；丹參素；原兒茶醛；丹酚酸B；高效液相色譜法復(fù)方丹參方由丹參、三七及冰片組成，具有活血化瘀，理氣止痛之功效，是臨床治療冠心病、胸悶、心絞痛的常用中藥處方1?，F(xiàn)用劑型有片劑、滴丸、顆粒劑、口服液、膠囊劑和氣霧劑等十余種2，中國藥典2000年版載有復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸兩種3。目前該方的各種制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)12個(gè)成分進(jìn)行了控制，這既不能全面反映復(fù)方的質(zhì)量，也難以對(duì)整方的功效進(jìn)行控制。為此，本研究根據(jù)復(fù)方丹參方中成分的理化性質(zhì)和藥理作用差

3、異，將之分為丹參水溶性成分、丹參脂溶性成分和三七皂苷類成分三大類，以方中的10個(gè)主要成分為指標(biāo)，建立復(fù)方丹參方的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并在此基礎(chǔ)上探討了不同配比組方間成分的含量變化規(guī)律。本文主要研究的是復(fù)方丹參方中丹參的水溶性成分，實(shí)驗(yàn)選擇了丹參素、原兒茶醛和丹酚酸B作為指標(biāo)成分進(jìn)行檢測(cè)，其中丹酚酸B在該復(fù)方中的HPLC測(cè)定為首次報(bào)道。實(shí)驗(yàn)部分1 儀器與試藥試藥 甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，醋酸、乙酸乙酯為分析純。丹參素和丹酚酸B對(duì)照品（天津天士力集團(tuán)提供，經(jīng)熔點(diǎn)、TLC及光譜數(shù)據(jù)證明為純品，純度大于98%），原兒茶醛對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所），丹參提取物和三七提取物（自制）。2 色譜條件H

4、ypersil C18（5m）4.6mm×250mm色譜柱，丹參素和原兒茶醛以甲醇-乙腈-0.5%醋酸（2.5：3.5：94）為流動(dòng)相，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長為281nm，色譜圖見圖1；丹酚酸B以乙腈-0.5%醋酸（20：80）為流動(dòng)相，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長253nm，色譜圖見圖2。3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制 精密稱取1.4mg原兒茶醛于25ml容量瓶中，用1%醋酸稀釋至刻度，搖勻，取1.0ml該溶液用1%醋酸稀釋至10ml作為貯備液1；精密稱取3.1mg丹參素于10ml容量瓶中，用1%醋酸稀釋至刻度，作為貯備液2；精密稱取3.0mg丹酚酸B于

5、10ml容量瓶中，用1%醋酸稀釋至刻度，作為貯備液3。3.2 線性關(guān)系和回歸方程l定容，得丹參素和原兒茶醛對(duì)照品混合液，精密取10l進(jìn)樣。另分別吸取0.1ml、0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml貯備液3于5個(gè)5ml容量瓶中，加1%醋酸稀釋至刻度，其余操作同上，即得丹酚酸B對(duì)照品溶液，精密取10l進(jìn)樣。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)作圖，得丹參素回歸方程為Y = 581.39X-62.5，線性范圍為3.1×10-16.2g，相關(guān)系數(shù)r = 0.9991；原兒茶醛回歸方程為Y = 4157X-3.43，線性范圍為5.6×10-31.12×10

6、-1g，相關(guān)系數(shù)r = 0.9996；丹酚酸B回歸方程為Y = 504.88X-30.7，線性范圍為3×10-14.5g，相關(guān)系數(shù)r = 0.9998。4 樣品的測(cè)定 “標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”方法進(jìn)行處理和測(cè)定。結(jié)果見表1、表2。表1 新制樣品中丹參水溶性成分的含量樣品（丹參/三七）10/010/110/310/610/101/10丹參素的濃度（mg/ml）1.981.671.391.270.970.18原兒茶醛的濃度（g/ml）55.341.635.430.824.13.7丹酚酸B的濃度（mg/ml）26.023.619.916.114.12.6表2 4放置4個(gè)月的樣品中丹參水溶性成分的

7、含量樣品（丹參/三七）10/010/110/310/610/101/10丹參素的濃度（mg/ml）1.771.661.391.050.910.19原兒茶醛的濃度（g/ml）45.770.636.228.023.23.8丹酚酸B的濃度（mg/ml）19.218.715.712.618.72.05 方法的評(píng)價(jià)5.1 精密度試驗(yàn) 取丹參素和原兒茶醛對(duì)照品混合液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得丹參素RSD = 1.5 % ，原兒茶醛RSD = 1.9 % ；丹酚酸B重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得丹酚酸B的RSD = 2.4 %。5.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取樣品按測(cè)定方法由始至終平行操作6份，測(cè)得丹參素RSD = 1.5 % ，原兒

8、茶醛RSD = 2.4 %，丹酚酸B的RSD = 1.9 % 。5.3 回收率試驗(yàn) 取樣品加入已知量的丹參素、原兒茶醛和丹酚酸B，按測(cè)定方法由始至終平行操作6份，丹參素回收率為99.8 %，RSD = 1.2 % ，原兒茶醛回收率為98.9 %，RSD = 1.9 %，丹酚酸B回收率為97.8 %，RSD = 2.8 %。5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 觀測(cè)樣品液在室溫下放置0h、2h、4h、6h、8h丹參素、原兒茶醛丹酚酸B的含量變化，丹參素RSD = 1.2 % ，原兒茶醛RSD = 2.7 % ，丹酚酸B的RSD = 2.2 %，結(jié)果表明樣品在8小時(shí)內(nèi)含量穩(wěn)定。5.5 最小檢測(cè)限 將丹參素、原兒茶醛

9、和丹酚酸B分別配成濃度很低的溶液進(jìn)樣，以S/N10為定量限，S/N3為檢測(cè)限，測(cè)得丹參素最低定量限為30ng，最小檢測(cè)限為9ng；原兒茶醛最低定量限為0.54ng，最小檢測(cè)限為0.14ng；丹酚酸B最低定量限為30ng，最小檢測(cè)限為12ng。討論1 曾對(duì)不同比例流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-0.5%醋酸，甲醇-乙腈-0.5%醋酸，乙腈-0.5%醋酸）進(jìn)行了比較，最后以甲醇-乙腈-0.5%醋酸（2.5：3.5：94）作流動(dòng)相，能使丹參素、原兒茶醛與干擾成分達(dá)到基線分離；以乙腈-0.5%醋酸（20：80）作流動(dòng)相，能使丹酚酸B不受其它成分的干擾。2 在樣品處理過程中，丹參素、原兒茶醛和丹酚酸B的萃取回收率與溶液PH密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明，用1mol/lHCl調(diào)節(jié)樣品溶液PH=1.2時(shí)萃取回收率高，當(dāng)PH高于或低于1.2時(shí)均會(huì)使萃取回收率變低。3 從各樣品的含量測(cè)定結(jié)果可見，復(fù)方丹參方中丹參的水溶性成分以丹酚酸B含量為最高，其次是丹參素，然后是原兒茶醛。4 由新制樣品與4放置4個(gè)月的樣品中丹參水溶