蛋白質(zhì)藥物長效化技術的現(xiàn)狀和進展-

1、中國生物工程雜志China B i otechnol ogy,2009,29(1:114118蛋白質(zhì)藥物長效化技術的現(xiàn)狀和進展3邊蕾石屹峰33(大連工業(yè)大學生物與食品工程學院大連116034摘要綜述了提高蛋白質(zhì)藥物半衰期技術的最新進展。由于蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)會被快速清除,所以患者必須頻繁用藥才能保持藥物濃度,限制了其治療效果。因此,延長蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)的半衰期并阻止其被快速清除已成為近年來的研究熱點。已建立的提高蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術包括化學修飾、蛋白質(zhì)融合、微囊化、糖基化、抗蛋白酶突變體等,許多長效蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)研制成功并應用于臨床治療。闡述了這些技術的原理并通過實例比較和評價了各種技術的優(yōu)點和

2、適用范圍。關鍵詞化學修飾蛋白質(zhì)融合微囊化糖基化抗蛋白酶突變體中圖分類號Q51Q816收稿日期:2008209208修回日期:20082102233遼寧省教育廳重點實驗室資助項目(2008S01533通訊作者,電子信箱:shiyfdl pu .edu .cn隨著生物技術的飛速發(fā)展,蛋白質(zhì)藥物已成為生物技術新藥的主要品種。如促紅細胞生長素、粒細胞集落刺激因子(G 2CSF 、干擾素、白介素、胰島素以及各種疫苗等。目前已有40種以上重要的治療藥物上市,720多種生物技術藥物正進行2期臨床試驗或接受FDA 審評,其中200種以上的藥物進人最后的批準階段1。但是蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)會被快速清除,這是由于組織

3、中大量存在的蛋白酶,能夠水解蛋白質(zhì)藥物,使其喪失活性,同時由于腎小球的濾過作用,分子量小于69kDa 的分子在代謝過程中易被清除,肝臟在藥物代謝過程中也具有重要作用,因而蛋白質(zhì)藥物半衰期都很短。為了維持一定的療效需要大劑量頻繁用藥,長期的反復注射不僅增加了病人的痛苦而且易引發(fā)一系列副反應。因此臨床上需要研制長效的蛋白質(zhì)藥物。目前,已經(jīng)建立的改善蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術包括:蛋白藥物的化學修飾、蛋白質(zhì)融合、微囊化/納米粒、糖基化、構建抗蛋白酶突變體等2。本文將上述五種技術用于蛋白質(zhì)藥物長效化的研究進展作一綜述。1化學修飾化學修飾是延長蛋白質(zhì)藥物半衰期的一個有效途徑。它是一種將分子量小的蛋白質(zhì)藥物共

4、價連接到具有較大分子量的分子上,例如聚乙二醇和白蛋白,共價連接到大分子上能減小免疫原性,改善可溶性和生物學利用度,以及增加抗蛋白水解作用,同時也能夠延長半衰期。然而,生物活性分子共價修飾的作用被內(nèi)在生物活性的損失所限制,例如,由于空間位阻而使受體結合減少,無活性分子整合到活性肽的一個或多個位點而產(chǎn)生的異質(zhì)性。終產(chǎn)物的結構異質(zhì)性通常伴隨著功能異質(zhì)性,致使生物活性或酶活性減小。聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG 是由環(huán)氧乙烷聚合而成的大分子聚合物,PEG 類修飾劑和其他修飾劑相比,具有無毒性,良好的溶解性,免疫原性低,且相對分子量范圍寬,選擇余地大等優(yōu)點。而且PEG 可以將它的

5、許多優(yōu)良特性賦予修飾后的生物分子。經(jīng)聚乙二醇共價修飾后,蛋白質(zhì)藥物的相對分子質(zhì)量有所增加,減少了藥物排泄,增加其抵抗蛋白酶分解的穩(wěn)定性,降低免疫原性,這些改變均有利于延長藥物在體內(nèi)的半衰期,從而,蛋白質(zhì)藥物的藥代動力學和藥效性質(zhì)得到明顯改善。例如,PEG 修飾的干擾素2(I FN 2與未修飾的IF N 2相比,半衰期延長1020倍;超氧化物歧化酶PEG 修飾前半衰期為5m in,PEG 修飾后半衰期延長至4.2h 3。Stigsnaes 等4用PEG5000修飾胰高血糖素,然后檢驗此種修飾對胰高血糖素的構象和生物學穩(wěn)定性的2009,29(2邊蕾等:蛋白質(zhì)藥物長效化技術的現(xiàn)狀和進展影響。檢測胰高

6、血糖素樣品和PEG修飾的胰高血糖素的二級結構,并評估其物理穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)未經(jīng)修飾的胰高血糖素,分子間形成了許多2折疊結構,成纖維的延遲時間短;而PEG修飾后的胰高血糖素只有少量的分子間2折疊,并未出現(xiàn)纖維,物理穩(wěn)定性明顯高于前者。1991年,第一種經(jīng)聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物PEG腺苷脫氨酶被F DA批準上市,用于治療一種嚴重的兒童免疫缺陷癥。2001年,PEG修飾的干擾素(PEG2intr on獲F DA批準上市,用于治療慢性丙型肝炎。迄今為止,國外已有多種PEG修飾的蛋白質(zhì)類藥物應用于臨床5。目前已經(jīng)上市的PEG化的蛋白藥物有PEG化的L2天冬酰胺酶(Enzon公司的Oncas par、PEG

7、化的干擾素22b(I FN22b(Schering公司的PEGI ntr on、PEG化的干擾素22a(IF N22a(Roche公司的Pegasys和PEG化的粒細胞集落刺激因子(G2 CSF(Amgen公司的Neulasta6。除了上述這些已上市的長效PEG化蛋白質(zhì)藥物外,處于臨床前研究的還有:超氧化物歧化酶(即將上市,Enzon公司、白介素22 (期,Chiron公司、水蛭素(期,BASF AG公司等,這些重組蛋白質(zhì)藥物在上市之后都會有預期的長效。2蛋白質(zhì)融合應用蛋白質(zhì)融合能夠構建具有雙功能的目的蛋白,這種融合蛋白是將兩個或多個基因的編碼區(qū)首尾連接,由同一調(diào)控序列控制構成的基因表達產(chǎn)物。

8、在分子水平,這個技術具有設計簡單靈活的特性,因為構建突變體時不需要插入連接序列而直接在C2端或N2端融合。因此,這種技術能廣泛地應用于構建生物活性分子,而且它的應用性不會因為生物分子的大小或活性而受到限制。常選用半衰期較長,分子量較大的分子作為載體構建融合蛋白,人血清白蛋白(HS A或免疫球蛋白(IgG的Fc片段應用最為廣泛。故以人血清白蛋白和Fc片段的融合技術為代表進行闡述。人血清白蛋白是血漿中含量最多的蛋白,分子量67kDa,它在血管和血管外室的循環(huán)中分布廣,半衰期可達到19天,且結構非常穩(wěn)定,無明顯的免疫原性,是血液中重要的物質(zhì)輸送和藥物運輸載體,所以它成為藥物設計理想的載體蛋白,用于改

9、善藥物的半衰期,延遲藥物清除,增加藥物暴露,減少注射頻率,改善病人對治療的順從性和耐受性。目前,多種蛋白與HS A融合后在實驗動物體內(nèi)半衰期的延長得到了證實,例如成功地將白蛋白與激素(胰島素7天然胰高血糖素2 18、人生長激素、細胞因子(干擾素22b2、I L22等融合,獲得更穩(wěn)定的循環(huán)蛋白,融合蛋白同時具有人血清白蛋白的長半衰期,和生物學活性及治療特性。通過此技術已對許多蛋白質(zhì)進行了改造。人胰島素/白蛋白融合蛋白(A lbulin在小鼠體內(nèi)半衰期比天然胰島素提高了42倍。在畢赤酵母中表達的胰高血糖樣肽素21融合蛋白(G LP21/HS A在小鼠體內(nèi)的半衰期比單獨的G LP21延長4倍。干擾素

10、2融合蛋白(I FN2/HS A的半衰期比未融合的干擾素2(I FN2延長了大約18倍。Müller等9為了延長幾種雙特異性抗體(scFv2、scDb、taFv的半衰期,將它們與HS A融合后,不僅穩(wěn)定性大大提高(半衰期大于4天,scFv22HS A的半衰期由5m in增加至117m in,scDb2HS A由8m in增加至43 m in,taFv2HS A也由9m in增加至37m in。利用抗體Fc段所特有的生物學功能與某些多肽或蛋白融合也可增加該蛋白質(zhì)的血漿半衰期。人I gG 免疫球蛋白是體內(nèi)的主要抗體,它的半衰期約為20天。I gG融合蛋白的構建方式大多是將I gG的Fc

11、(H inge2CH22CH3片段或CH(CH12H inge2CH22CH3片段的N端與活性蛋白的C端相連。I L210是一種抗炎癥因子,制備重組I L210/I gG2Fc 融合蛋白能明顯延長I L210的半衰期。免疫粘合素(i m munoadhesin是通過將受體的靶向結合區(qū)域,粘附分子,配體或者酶融合到I gG的Fc片段構成,用來治療自身免疫性疾病。王磊等10構建了I FN22b與人I gG 免疫球蛋白Fc片段的融合基因(IFN2b2Fc并在畢赤酵母中以二聚體形式分泌表達,不同亞型Fc片段的融合蛋白對IF N22b抗病毒活性均有一定影響,大鼠皮下注射后循環(huán)血液中半衰期達65h,血液中

12、存留時間120h以上,比商品重組干擾素體內(nèi)半衰期延長了8倍。3微囊化微囊化技術已廣泛用于增強治療因子的藥代動力學特性,改進藥物穩(wěn)定性以及使藥物靶向釋放等方面。用微囊包埋蛋白質(zhì)和多肽藥物,不僅可以通過緩釋作用實現(xiàn)長效皮下注射制劑,而且可以通過微囊表面和粒徑的設計,實現(xiàn)口服、黏膜給藥、吸入等新劑型。此技術的原理是將藥物活性部分包封于聚合層中,通過511皮下或肌肉給藥,聚合層隨著時間減少,使藥物從微囊中緩慢持續(xù)釋放,這有利于穩(wěn)定藥物,減少胃腸道酶的破壞,改變其體內(nèi)運轉過程,延長藥物在體內(nèi)的作用時間?，F(xiàn)在蛋白質(zhì)藥物的微球注射制劑已經(jīng)研究成功并應用于臨床。它是用生物可降解聚合物作為骨架材料包裹蛋白質(zhì)藥物

13、制成直徑為1250m的可注射微球劑,生物可降解聚合物主要包括淀粉、明膠、葡聚糖、白蛋白、聚乳酸(PLA、聚乳酸2乙醇酸共聚物(PLG A、聚鄰酯、聚內(nèi)酯和聚酐等11。目前用于制備緩釋微球的骨架材料主要是PLG A和PLA,其中又以PLG A更為常用。此外,美杜莎持續(xù)釋放系統(tǒng)12也被用于蛋白質(zhì)藥物緩釋過程中,它是由多聚L2谷氨酸骨架組成,帶有疏水的2生育酚分子,形成毫微球粒的膠體懸液。由于毫微球粒的疏水區(qū)域的藥物相互作用產(chǎn)生了持續(xù)釋放藥物的效果。在體內(nèi),蛋白質(zhì)藥物被生理溶液中內(nèi)源蛋白代替,導致藥物緩釋。蛋白質(zhì)藥物最高濃度顯著降低,藥物釋放明顯延長。美杜莎持續(xù)釋放技術已經(jīng)應用于靜脈注射I L22和

14、I FN2(2b,臨床上已經(jīng)應用于腎癌和丙型肝炎C的治療。目前聚乳酸及其共聚物類緩釋制劑已經(jīng)上市的藥物有,促甲狀腺激素釋放激素TRH類藥物曲普瑞林(商品名Decapep ty1P LG A緩釋微球,用于治療前列腺癌,可緩慢釋藥1個月,是第一個多肽微球產(chǎn)品。亮丙瑞林(Leup r orelinPLG A緩釋微球,主要用于前列腺癌及子宮內(nèi)膜異位癥,也可釋藥1個月。以后又有多種LHRH類似物的緩釋微球注射劑先后上市。還有不少蛋白質(zhì)藥物的緩釋微球注射劑正在實驗室研究或動物試驗階段。4抗蛋白酶突變體生物藥物的蛋白酶水解作用是給藥技術發(fā)展中需要突破的重要障礙。因為蛋白質(zhì)很容易被內(nèi)源血清中或組織中蛋白酶分解

15、,并且蛋白酶對蛋白的降解可以發(fā)生在吸收、分布及排泄等各個階段,這就直接影響藥物的體內(nèi)半衰期、生物利用度、血漿清除率等參數(shù)。將一個或多個抗蛋白水解突變體引入到生物活性分子上,是藥物設計和發(fā)展的研究焦點。體內(nèi)的穩(wěn)定作用也通過引入人造氨基酸類似物(2am ino acids而達到。這些變體發(fā)生細小的構象變化,導致增強抗蛋白水解作用。例如,通過取代蛋白質(zhì)一級結構中任意肽鍵,提高蛋白藥物抵抗蛋白酶降解的穩(wěn)定性,在模擬肽的生物活性的基礎上,通過肽的骨架修飾,改變肽的主體結構,是擬肽設計的目標13。Markert等14為了提高核糖核酸酶A(RNase A抵抗蛋白酶K和枯草桿菌蛋白酶水解的能力,通過定點突變,

16、用Pr o替代了A la20,經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)突變體酶(A la20Pro2RNase A的構象沒有發(fā)生明顯的變化,生物活性也和野生型RNase A一樣,但是抵抗蛋白酶水解的能力顯著增加。通過S DS2PAGE電泳結果顯示,蛋白酶水解常數(shù)下降2倍。5糖基化蛋白質(zhì)表面的糖鏈能夠影響蛋白的藥物動力學性質(zhì)、生物活性和穩(wěn)定性等,并且,糖基化是某些蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性所必需的。對比治療性蛋白質(zhì)的糖基化形式和非糖基化形式,一方面蛋白質(zhì)藥物表面增加了側鏈,提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性,阻礙蛋白酶對蛋白藥物的降解作用,另一方面使蛋白質(zhì)藥物分子量增大,減少腎小球濾過。促紅細胞生成素(EPO是一個高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白,它

17、含有3個N2糖鏈和1個O2糖鏈。構建重組人促紅細胞生成蛋白,分別在33和88位各增加一個N2糖基化位點,研究結果發(fā)現(xiàn)重組人EPO的體內(nèi)半衰期是EP O的3倍15。重組人EPO的O2糖基化對于體內(nèi)外活性及清除速率作用無關,而N2糖基化不完全的重組人EP O體外活性正常,體內(nèi)活性則降低到體外活性的1/500,且體內(nèi)清除率也明顯加快。因此, N2糖基化對蛋白質(zhì)藥物的修飾有重要作用。重組人EPO突變體(Amgen公司的A ranes p已經(jīng)研制成功并上市。組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tP A在體循環(huán)中的清除率很高,半衰期僅為6m in。Keyt等16構建了tPA 變體,發(fā)現(xiàn)突變體具有減少tPA血漿清除率

18、的特性,同時保持正常的纖維蛋白結合能力和血塊溶解活性。有效延長半衰期的tP A突變體是通過在Kringle1處進行糖基化修飾,用A sn替代Thr2103形成,即T2tPA。隨后在2962299位置發(fā)生四等位基因替換反應K NRR(2962 299AAA形成突變體(TK2tPA。TK2tPA表現(xiàn)出抗纖溶酶原激活劑抑制因子1的能力比tPA高80倍。TK2 tPA延長了體內(nèi)清除時間,能夠減小清除率,同時保持正常的凝血活性。因此可以作為有效的低劑量血栓溶解劑。6112009,29(2邊蕾等:蛋白質(zhì)藥物長效化技術的現(xiàn)狀和進展6結語綜上所述,目前已經(jīng)發(fā)展了許多有效提高蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術,各種蛋白質(zhì)藥

19、物長效化方法都能夠顯著改善生物制品的穩(wěn)定性,提高藥物的生物利用度,延長在體內(nèi)的半衰期。表1將各種技術作一歸納。表1幾種有效改善蛋白質(zhì)半衰期的技術Table1Severa l techn i ques tha t prolong the ha lf2li ves of prote i n drugs方法原理優(yōu)點難點臨床應用化學修飾通過將蛋白質(zhì)共價連接在大分子上,增大其分子量增加體內(nèi)半衰期;保護蛋白質(zhì)不被降解;減小腎清除率;增加溶解性/穩(wěn)定性減少組織吸收;免疫原性;功能異質(zhì)性;功能活性的保持PEG2I F N217;PEG2I F N22b18;PEG2G2CSF6蛋白質(zhì)融合技術將兩個或多個基因的

20、編碼區(qū)首尾連接,由同一調(diào)控序列控制構成的基因表達產(chǎn)物延長體內(nèi)半衰期;不需要修飾;設計靈活;減少腎清除;增加溶解性和穩(wěn)定性免疫原性;功能活性的保持alb2I F N21;alb2G LP2119;alb2insulin7;I F N2b2Fc10抗蛋白酶突變體引入一個或多個抗蛋白水解突變體到生物活性分子上增強穩(wěn)定性;保護蛋白質(zhì)不被降解免疫原性;功能活性的保持A la20Pr o2RNase A14微囊化將藥物包裹聚合層中,使藥物從微囊中緩慢持續(xù)釋放保持/靶向藥物釋放;防止蛋白質(zhì)被降解膠囊化效率;藥物釋放的效率;功能異質(zhì)性;功能活性的保持Poly L2Glunanoparticle12糖基化在蛋白

21、質(zhì)表面N2糖基化位點添加側鏈,增加蛋白質(zhì)分子量減少腎小球濾過;減少蛋白酶降解免疫原性;功能活性的保持重組人EP O15;TK2tP A16以藥物化學方法為基礎的傳統(tǒng)化學修飾和微囊化技術已經(jīng)發(fā)展成熟,有許多長效化蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)上市,還有很多已經(jīng)處于臨床期,很快就能用于治療。利用現(xiàn)代DNA重組技術的融合蛋白技術的蛋白質(zhì)藥物(A lbinterfer on22b也進入了臨床期。對治療疾病提供了更多選擇?；诘鞍踪|(zhì)工程的抗蛋白酶突變體和糖基化技術的研究也在深入進行。隨著各種技術的日益發(fā)展,會有更多的蛋白質(zhì)藥物應用在后基因組時代用于治療人類疾病。參考文獻工程雜志,2003,23(10:2327W ang

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