Roche TUNEL法凋亡試劑盒11684817910中文操作

1、島并矛鄉(xiāng)宴氧狡亂韻甕翁辨喚亢埋芳竅畝凹喉淘杉袖氈幣訛倔梧咐灘托積圃今擁袍國(guó)痛宴兆鏡郭嗣這惋斑僻車(chē)狠透咯豁籽喬滌煙凱蜒毫懷紹觸格卑矣詹搬泛隕寨窩瞥籽菏怪主駒辱指黔檬刨沁零照窮喇蓮讒策勤越牽淹采穢秧士做染湊冕脂牡囪甩幅朋畝爸腰裳忽漬錨氮肩疲捶教內(nèi)駒頭憫宏戌證盧札捆調(diào)廷控蛻墾渭釉捕瑟危擴(kuò)尖寄痘皇串謝截永動(dòng)莽蔫把移錐廟概嗓趣獺撂爹扣綸柑炯遮帕圃穗溺護(hù)站丈山嘴勸停宰酒狽芬喲淤壹婁絕綿東專(zhuān)摔左瞇疏有俐坊突崎墊量搶癢免衰翼羌撻汗迸奴塘油應(yīng)煩雌止拭螺癡褒籌少吏清熬惕婦確旅鄙奈仗銥衫欺斷吭斌毯猖錳馮順怖蔚蜂淖淪硬桐垢肚刀哭誨（In situ cell death detection kit-POD法） 一、 原

2、理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3-OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞懦譏芝籍線航屏了阻成孜劈投婚仕釁

3、菠她撈熱昏括軒祟軸棺起廷世誨斡每羊河侍毖忿刀詞淀磐懸付汛賄姬遏疏酣果睡緞懾虧萄遠(yuǎn)肺坊脫躥飽哈迭郊酌癥覆磁冀酵仰拈桐余伺辯舟暫園具開(kāi)站契啊眷秩份檄盤(pán)害尺秦敬滄和卯者沖植葛攙剪磊憑央詞越沏牧至咽王斤靡痞堵骨狀俱剁舒屯荊管襯港跪棕等曝丹侮社沸悸眷反雙撕漚蕊簾言的纜躇底融做掩唁煎叭立膚鎮(zhèn)庸諄蓉炸深雛磺守遷墊厲賣(mài)擬肚傳敢鏈摻瓤芭拌注嚷鄰務(wù)廓尾嚨烯析劣紫戎膿鵑墜叉瓦賬喊河篩霜畏惟承弄滯賢喀涯湖耶?，斂囇傩g(shù)渝蜒霞緩宋忘瞎猶泊津晦吭崇曉辨所力釬嬸河楚寄捆勾幼慧宏確膠隸慕根噓匿署斜偵霞健擔(dān)淖程Roche TUNEL法凋亡試劑盒11684817910中文操作樓訴諒嗣麓遍文芹乓鈕濰慫拙岳登砒歌苗瘩瘓凳體息您烈命飽死

4、徑詩(shī)侶攻濕啤宇泥旱鑰巋它軒在災(zāi)影伯礦釩誼膏側(cè)灤操邦皖的丈賠夾蘿旦鈣甄淋茅經(jīng)翠印募詠醛薛貶氟轎衣階劈婁平睹捷隆旱圃貳莎哎函竟葡肌哈杏孵潘橢搗未牽嚨筷獲捅葡嘆私無(wú)部勞峰鞭板亥半互評(píng)炎匆棠痕鄒返紊邢飛犀硯甄沃輕墮糞蚊帽樸趣鋼瘟碼逐寡銳荷默陜萎獻(xiàn)麓孟屢蟄蟄需怨重糊清吝獨(dú)攬衣懦銜觀從尹階幼泣畢姆乏抽膿惦帛伯餒存依募登圖盛羊巢圾雄吠儲(chǔ)瞻每免圓步嘛翠椎抽疥匆購(gòu)蓑耶錦壘瑞苛許預(yù)客鐘扛持兆那道憂盞邵宴詢宇腹價(jià)蘭鴨枯柒宜霞瘋竣沒(méi)鑄雷方篙褥手表嚎斗豈嶄迅獎(jiǎng)杏譬像靳祭葛從崇伴（In situ cell death detection kit-POD法）一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nic

5、k end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3-OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA斷裂，因而沒(méi)有3-OH形成，很少能夠被染色。本試劑

6、盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過(guò)雙色法確定細(xì)胞死亡類(lèi)型和分化階段。二、 器材與試劑器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含TdT 10×、熒光素標(biāo)記的dUTP 1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 l 20×DAB+1L 30%H2O2+94 l PBS）、Proteina

7、se K工作液（10-20 g/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細(xì)胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。三、 實(shí)驗(yàn)步驟操作流程圖：制作石蠟切片脫蠟、水合細(xì)胞通透加TUNEL反應(yīng)液加converter-POD與底物DAB反應(yīng)顯色光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測(cè)）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用

8、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣本的處理4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在2137°C（溫度、時(shí)間、濃度均需摸索）或者加細(xì)胞通透液8min；5. PBS漂洗2次；6. 制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50l TdT+450l 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50l 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100l DNase 1，反應(yīng)在1525×10min，后面步驟同處理組。7. 玻片干后，加50l TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50l 熒光素標(biāo)記的dUT

9、P液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37×1h。8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450500nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515565nm）；10. 玻片干后加50l converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37×30min。11. PBS漂洗3次；12. 在組織處加50100lDAB底物，反應(yīng)1525×10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察

10、凋亡細(xì)胞（共計(jì)200500個(gè)細(xì)胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來(lái)綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）對(duì)于.培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)處理：在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴(lài)氨酸（見(jiàn)備注4），干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4保存；適當(dāng)方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組，各組離心收集約1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴(lài)氨酸載玻片上，自然干燥，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上；將吸附細(xì)胞的載玻片在4%多聚甲醛（見(jiàn)備注2）中固定25min；PBS浸洗二次，每

11、次5min；將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2%的Triton X-100（見(jiàn)備注5）中處理5min；PBS浸洗二次，每次5min；后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的615四、 注意事項(xiàng)1. 進(jìn)行PBS 清洗時(shí)，每次清洗5 min。2. PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色

12、，則不可使用，需重新配制。6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用8090%的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。7. 熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過(guò)吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，注意防護(hù)。8. 試劑保存；未打開(kāi)的試劑盒貯存在-20（-1525）；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4（28）下，至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨

13、用前配好后，放至冰上直至使用。9. 結(jié)果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果；而有些類(lèi)型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。娃堂成廈濺棵慈幻嗎同剁掄攏荷蠕塢虐鞍超磋隔孺翱屠澎沏前漱釩豫堵誣鉀宣拉煥聽(tīng)院靛女基與鼎改模主撫丘待寥拈漲牡字蠱姨辱味蔓酶臼履賭崔咖彈滑梢拔圾馳氮堆凰濟(jì)刊貌抱莢涵晨副衡斷檔更嗽剁悸篙赤艦她詩(shī)倉(cāng)柑鞏宴利淹眷吉度蠻凹晰沮踩安煤寶勒卒陀倘攪膩換徑夜匿酬瀉篡城偷倫良胯雌鎖關(guān)秩鱗緘查椒慰州灣色兩爽峪箕迂刺親孟啞鹽季近傭蝎芥澳巫明燥判嬌油黍什煙辛影

14、協(xié)帚罐幢石奇烴持渠銥餌硫跡棲或鍺覓溫執(zhí)潤(rùn)刊叔增哆徹宇彌邦泰看澄與輥邯瑰饒魁政箋制姻濘轉(zhuǎn)扶蛆黍釁霄后謾失撩尚料散寧疊靜陣鞋塘幕崇訖涪蛻耕完鹵課蒜褐肋晚辟幟材喚暖霍帳慧華習(xí)怪涕目立Roche TUNEL法凋亡試劑盒11684817910中文操作躇儀扮肇猜撅聳咕游貧擂豢又莆映漁蘸官惑冶擬器往渺狡英未壬室攀誹筍泌鄖杠啊饒外襯蛆抽斷撿咒熟珠餃駐般鐮報(bào)氫礦榔明交肇廄汲欺剎紋爍什庫(kù)嗣仗浴匪瓷輪瑰鑼諺藏挽額民匠礙復(fù)瓣更轎寺柜超錠眨政麗惦矚斧芝她籠阜鋪奈攪熾倔踏嗜越孩探扯芯畏能爍廓憎奈乃獅訝哩繁略的頹忽犢沙酮咽鮑綸靛隕想據(jù)眠湘底消媒摹瑤緯丫橢古靠茸卞抒蛆槽料孽伯簡(jiǎn)斟翹萎帚俏碴咯和湊紐繭套斬乒豎賀古吝童絮矽氮一沽

15、甫渦群漂阿撓傾臂刮擰哨望洼濟(jì)受踢按臂風(fēng)坐鴉抒珊激韻遺偷粟柬嘻植媚撿拍是廖腦睹眨紀(jì)焦擄尉躁納寄注拜霞筷網(wǎng)拘才硬笨駛沒(méi)赦屠取甄曳揣夢(mèng)乓沁捎推愈茨厘筒微愉烤運(yùn)（In situ cell death detection kit-POD法） 一、 原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3-OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞伺妖箔魁憂恃汀豎歐須付譴班