基因治療用腺病毒載體研究進(jìn)展

1、基因治療用腺病毒載體研究進(jìn)展錄入:wei 來(lái)源:Internet 時(shí)間:2008-9-20 【字體:大中小】雙擊滾屏【摘要】近十年來(lái), 腺病毒載體已經(jīng)成為了基因治療的有效載體, 各種重組腺病毒在抗腫瘤和治療遺傳病等方面發(fā)揮了重要作用。本文介紹了腺病毒載體系統(tǒng)的特點(diǎn), 腺病毒的感染動(dòng)力學(xué)及包裝細(xì)胞代謝的變化和定量計(jì)數(shù)方法, 腺病毒生產(chǎn)和純化方法及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制, 對(duì)腺病毒生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)和存在問(wèn)題進(jìn)行了闡述?！娟P(guān)鍵詞】基因治療腺病毒載體生產(chǎn)方法【本頁(yè)關(guān)鍵詞】省級(jí)期刊征稿碩士畢業(yè)論文寫(xiě)作【正文】基因治療指的是把功能基因?qū)氩∪梭w內(nèi)使之表達(dá), 并因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)發(fā)揮了功能而使疾病得以治療。人類疾病的

2、發(fā)生都是人體細(xì)胞本身的基因改變或由外源病原體的基因及產(chǎn)物與人體相互作用的結(jié)果。長(zhǎng)期以來(lái)科學(xué)家們思考人類是否能依靠人本身的或是外源的遺傳物質(zhì)來(lái)治療疾病, 這就是基因治療的含義。從上世紀(jì)九十年代開(kāi)始, 腺病毒就作為了基因治療的有效載體, 已經(jīng)報(bào)道的1000 多種基因治療的臨床方案中, 約26% 是用腺病毒作為載體。腺病毒載體可以在包裝細(xì)胞內(nèi)高滴度復(fù)制, 是上呼吸道自然存在的溫和病毒, 可以感染多種分裂期和非分裂期的細(xì)胞。第一代腺病毒載體構(gòu)建的目的是為了治療幾種單基因疾病, 這種病毒載體通常刪除了E1 和E3 區(qū)以便插入目的基因1 , 而且要全身重復(fù)給藥才能將目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞內(nèi)。第二代腺病毒是復(fù)制

3、缺陷型病毒, 人們進(jìn)一步刪除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出現(xiàn)。人們又構(gòu)建了第三代腺病毒載體, 也叫假病毒或輔助依賴性腺病毒2- 4 。1、腺病毒的感染動(dòng)力學(xué)及包裝細(xì)胞代謝的變化刪除E1 和E3 區(qū)的腺病毒基因組長(zhǎng)約36kb, 其容納外源基因的的長(zhǎng)度在7 8kb。腺病毒感染包裝細(xì)胞的過(guò)程可以分為三步: 一是擴(kuò)散和吸附, 病毒擴(kuò)散并吸附在細(xì)胞表面。二是結(jié)合并擴(kuò)散入細(xì)胞核, 這一階段通常通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用來(lái)完成。三是基因轉(zhuǎn)錄及DNA 復(fù)制。在動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)中, 限制細(xì)胞生長(zhǎng)的因素很多, 包括所需營(yíng)養(yǎng)的缺乏、代謝副產(chǎn)物的抑制、傳氧速率的限制、pH 的變化和剪切力的損傷

4、等5 , 其中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響尤為重要。在培養(yǎng)基中葡萄糖是主要的碳源和能源物質(zhì), 谷氨酞胺則是主要的氮源和能源物質(zhì), 它們?cè)趧?dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和代謝產(chǎn)物形成過(guò)程中起著重要作用。葡萄糖是主要的碳源和能源物質(zhì), 經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程, 絕大部分生成乳酸釋放到培養(yǎng)液中6 , 同時(shí)提供能量(A TP 和還原力(NADH , 少部分通過(guò)磷酸戊糖途徑生成核酸的前體一核糖, 僅有極少部分進(jìn)入TCA 循環(huán)7, 8 , 并且直接參與了谷氨酞胺的代謝過(guò)程。2、腺病毒的定量和計(jì)數(shù)方法在研發(fā)新生產(chǎn)工藝的早期階段容易忽視的一個(gè)重要問(wèn)題就是腺病毒的定量, 定量問(wèn)題在腺病毒基因治療的最終臨床應(yīng)用中更為重要。現(xiàn)在生產(chǎn)企業(yè)

5、和學(xué)術(shù)研究人員已經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到了腺病毒定量的重要性。為了不同實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)能進(jìn)行相互比較,美國(guó)成立了一個(gè)腺病毒參考物質(zhì)工作組, 目的是建立腺病毒的參考標(biāo)準(zhǔn)品。世界上所有的研究和開(kāi)發(fā)機(jī)構(gòu)都可以獲得此標(biāo)準(zhǔn),以便對(duì)腺病毒的定量方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以及方便對(duì)臨床前和臨床資料的解釋。人們建立了陰離子交換的高壓液相方法定量檢測(cè)腺病毒顆粒, 該方法的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性較紫外分光光度計(jì)法顯著提高9 。其它的方法還有熒光標(biāo)記病毒DNA 以及測(cè)定病毒六鄰體蛋白的方法等。有趣的是人們注意到V ellekamp 等10 近來(lái)報(bào)道了關(guān)于觀察不同色譜柱純化的腺病毒批次間病毒空殼的差異情況。3、腺病毒的生產(chǎn)方法腺病毒生產(chǎn)方法根據(jù)包裝細(xì)

6、胞不同而分為貼壁細(xì)胞培養(yǎng)與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。主要用于E1 區(qū)缺失腺病毒生產(chǎn)的包裝細(xì)胞為起源于人胚腎的293 細(xì)胞, 此細(xì)胞包含有腺病毒缺失的E1 區(qū)。許多懸浮和無(wú)血清馴化的細(xì)胞克隆在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以獲得, 293細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性現(xiàn)在已經(jīng)被詳細(xì)闡明, 而且正在用于符合GM P 標(biāo)準(zhǔn)的工業(yè)化生產(chǎn)中。免費(fèi)獲得該細(xì)胞系以及生產(chǎn)的病毒滴度高是293 細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于商業(yè)化生產(chǎn)而言, 懸浮細(xì)胞系比較適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn), 而且懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般可以在無(wú)血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng), 不添加任何其它動(dòng)物來(lái)源的添加劑, 這樣就有利于分離純化。灌注培養(yǎng)是對(duì)流加模式改進(jìn)后的一種培養(yǎng)方法, 通過(guò)不斷更換新鮮培基,同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞截留

7、裝置使細(xì)胞保留于生物反應(yīng)器內(nèi), 可以順利實(shí)現(xiàn)培基的原位交換。一些作者建議用灌注培養(yǎng)的方法獲得高密度的細(xì)胞, 然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其它生物反應(yīng)器中生產(chǎn)腺病毒。灌注培養(yǎng)模式已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可和接受, 并且成為腺病毒大量生產(chǎn)最常用的培養(yǎng)模式。4、腺病毒的純化方法重組腺病毒的純化是大規(guī)模生產(chǎn)中的關(guān)鍵問(wèn)題, 最經(jīng)典的純化方法是兩步氯化銫密度梯度超速離心法, 此方法是生產(chǎn)小量臨床級(jí)產(chǎn)品的有效方法。但這一工藝放大困難, 需要建立適用于大規(guī)模生產(chǎn)的純化技術(shù)。人們不斷地努力研發(fā)可用于大規(guī)模生產(chǎn)的腺病毒分離純化工藝, 如離子交換、疏水性相互作用、金屬鰲合和凝膠過(guò)濾等11, 12 。近年來(lái)陰離子交換樹(shù)脂已經(jīng)逐漸成為主

8、要分離純化手段, 得到了較好的結(jié)果。經(jīng)常使用的陰離子交換樹(shù)脂主要有Q Sepharo se XL、Source 15Q 以及DEA E 等, 回收率均能達(dá)到65% 以上, 分離效果也較好。Green 等13 提出離子交換層析后使用聚四氟乙烯樹(shù)脂層析法除去第一步離子交換未除盡的宿主和病毒蛋白, 還有學(xué)者提出采用離子交換和凝膠過(guò)濾相聯(lián)合的方法進(jìn)行純化, A rcand 等14 提出先進(jìn)行F ractogelEMD DEA E - 650 離子交換層析, 而后進(jìn)行Sephacryl S -400HR 凝膠過(guò)濾的純化方法。最近有文獻(xiàn)報(bào)道15, 16 , 利用陽(yáng)離子去垢劑沉淀宿主DNA 方法來(lái)分離純化腺

9、病毒, 他們的方法是首先在細(xì)胞裂解液中加入氯化十六烷基嘧啶或溴化度滅芬等陽(yáng)離子去垢劑進(jìn)行充分?jǐn)嚢杌旌? 此時(shí)宿主DNA 就會(huì)被沉淀, 隨后經(jīng)過(guò)兩次超濾去除DNA 沉淀, 最后再經(jīng)過(guò)Source 15Q 分離純化, 他們報(bào)道最后腺病毒的回收率均大于50%。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是費(fèi)用低廉, 容易進(jìn)行放大, 非常適合商業(yè)化生產(chǎn)。 5、腺病毒產(chǎn)品的質(zhì)量控制生產(chǎn)過(guò)程中復(fù)制完全型腺病毒的測(cè)定非常關(guān)鍵, 通常是用 74 科技信息高校理科研究敏感細(xì)胞的細(xì)胞致死效應(yīng)來(lái)測(cè)定, 但是這種方法周期長(zhǎng), 現(xiàn)在更靈敏的方法是PCR. RCA 的出現(xiàn)促使人們?nèi)ふ腋煽康陌b細(xì)胞株。對(duì)重組腺病毒的質(zhì)量控制貫穿于整個(gè)生產(chǎn)純化過(guò)

10、程, 包括包裝細(xì)胞、病毒、粗分離產(chǎn)品、純化產(chǎn)品和最終產(chǎn)品。Roetsch等人17, 18 從穩(wěn)定性、有效性和純度三個(gè)方面詳細(xì)報(bào)道了基因治療中重組腺病毒的質(zhì)量控制手段。穩(wěn)定性包括病毒基因組的穩(wěn)定性和治療基因表達(dá)的穩(wěn)定性, 前者的檢測(cè)用酶切、電泳和Southern blo t 等方法。有效性包括總病毒顆粒數(shù)與病毒滴度之間的比例和具有感染效力的病毒顆粒中治療基因有效表達(dá)的比例, 在臨床治療中病人接受的劑量用病毒總顆粒數(shù)表示。所以上述兩種比例就顯得尤為重要。純度包括野生型RCA 的檢測(cè)、雜蛋白污染檢測(cè), RCA s 的檢測(cè)用生物法和PCR 法, 雜蛋白污染的檢測(cè)用反相HPLC 和MALD I- TO

11、F 質(zhì)譜聯(lián)用法。6、腺病毒生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)與存在問(wèn)題在過(guò)去幾年中, 新的腺病毒載體不斷研制成功, 對(duì)腺病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)工藝提出了迫切的要求, 人們嘗試了各種方法,通過(guò)腺病毒載體生產(chǎn)工藝的改進(jìn), 使得重組腺病毒的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。包裝細(xì)胞的培養(yǎng)工藝逐漸轉(zhuǎn)向無(wú)血清懸浮灌注培養(yǎng)方式, 以增加細(xì)胞密度, 提高病毒產(chǎn)量。由于目前大量的研究主要集中在包裝細(xì)胞的培養(yǎng)工藝和腺病毒的純化和計(jì)數(shù)方法,病毒在宿主細(xì)胞中的DNA 復(fù)制和成熟的機(jī)制知之甚少, 最終提高病毒的產(chǎn)率和滴度以及完善流加和灌注工藝還有賴于對(duì)病毒復(fù)制與成熟機(jī)制的了解。在整個(gè)重組腺病毒的生產(chǎn)純化工藝中,純化和計(jì)數(shù)是比較薄弱的環(huán)節(jié), 雖然目前探索

12、了不少的純化計(jì)數(shù)方法, 但是其中所用到的設(shè)備和材料價(jià)格昂貴, 所以還有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)適合大規(guī)模純化要求的設(shè)備和材料, 或者成本低廉的純化工藝。質(zhì)量控制是生產(chǎn)中非常重要的一環(huán), 它應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容: 首先, 它不僅是對(duì)最終產(chǎn)品質(zhì)量的把關(guān), 還應(yīng)該貫穿在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中; 其次, 國(guó)內(nèi)和國(guó)外目前對(duì)于應(yīng)用在臨床的重組腺病毒載體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還很不完善, 所以在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定方面應(yīng)加大研究力度, 從而提高產(chǎn)品的治療效果, 減少副作用的發(fā)生。參考文獻(xiàn) 1 Danth inne X, Imperiale MJ. P roduct ion of firstgenerat ion adenovirus vecto

13、 rs: a review. Gene Ther, 2000. 7:1707- 1714. 2 L uskyM , Ch ristM , R it tner K, et al. In vit ro and in vivobio logy of recombinant adenovirus vecto rsw ith E1, E1öE 2A , o rE1öE4 deleted. J V iro l, 1998. 72: 2022- 2032.3 Yeh P, Dedieu J - F, O rsini C, et al. Efficient dualt ranscomp l

14、ementat ion of adenovirus E1 and E4 regions from a293- derived cell line exp ressing a m inimal E4 funct ionnal unit.JV iro l, 1996. 70: 559- 565. 4 Park s RJ , Chen L ,A ntonM , et al. A helper- dependentadenovirus vecto r system: removal of helper virus by Cre -mediated excision of the viral packa

15、ging signal. P roc N at l A cadSciU S A , 1996. 93: 13565- 13570. 5 H iller GW ,A esch limann AD, Clark DS, et al. A k inet icanalysis of hybridoma grow th and metabo lism in cont inuoussuspension culture on serum - free m idium. B io techno l.B ioeng. , 1991. 38: 733- 741.6 林福玉, 陳昭烈, 劉紅等. 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

16、的問(wèn)題及對(duì)策. 生物技術(shù)通報(bào), 1999, 10 (1 : 58- 64. 7 Reitzer L. J. ,W ice B. M. , Kennell D. . Evidence thatglutam ine, no t sugar, is the majo r energy source fo r clucuredHela cells. J. B io. Chem. , 1979. 254: 2669- 2674. 8 Zielke, H. R, et al, Glutam ine: A majo r energy sourcefo r cultured mammalian cells,

17、Fed. O roc. , 1984. 43: 121- 125. 9 T ransfiguracion J , Bernier A , A rcand N ,. et al.Development and validat ion of a h igh - perfo rmance liquidch romatography - tandem massspect romet ry assay fo r thedeterm inat ion of sanfet rinem in human p lasma. J Ch romatogr BB iomed SciApp l. , 2001. 761

18、(2 : 187- 194. 10 V ellekamp G, Po rter FW , Sut jip to S, et al. Emp tycap sids in co lumn - purified recombinant adenovirusp reparat ions. Hum Gene Ther, 2001. 12: 1923- 36. 11 Gilbert PA , Garnier A , Jacob D, et al. O n - linemeasurement of GFP fluo rescence fo r the monito ring ofrecombinant ad

19、enovirus p roduct ion. B io techno l L et t, 2000. 22:561- 567.12 N adeau I, Jacob D, Perrier M , et al. 293SF metabo licflux analysis during cell grow th and infect ion w ith an adenoviralvecto r. B io techno l P rog, 2000. 16: 872- 884. 13 Green A P, Huang JJ , Sco t tMO , et al. A new scalablemethod fo r the purificat ion of recombinant adenovirus vecto rs.Hum Gene Ther, 2002. 13: 1921- 1934. 14 A rcand N , Bernier A , T ransfiguracion J , et al.A denovirus type 5 (A d5 ch romatograph ic purificat ion p rocessat 20L scale. B iop rocess J , 2003. 2: 72- 75.