糖化血紅蛋白檢測原理及意義

1、精品糖化血紅蛋白（HbAIC測定的原理方法及臨床意義綜述2007 年 3 月 19 日糖化血紅蛋白（HbAlc）測定的原理方法及臨床意義綜述馮念倫范衛(wèi)華劉捍東（山東省立醫(yī)院 濟(jì)南 250021）糖尿?。―M）,主要是 2 型糖尿病的發(fā)病率，目前在世界上無論發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家均明 顯增加，占免疫病的比率，在發(fā)達(dá)國家高達(dá)2-5%，而我國糖尿病的發(fā)病率亦達(dá)2-3%，并且每年還以 1 %。的速度增長。糖尿病是一種終生性疾病，其并發(fā)癥已經(jīng)成為病人至殘和早亡的 主要原因，所以人們希望能盡早發(fā)現(xiàn)和治療糖尿病。有資料說美國用于糖尿病的治療費約有 1000 億美元，糖尿病已經(jīng)成為世界各國的主要保健 衛(wèi)生問題

2、，對糖尿病及其并發(fā)癥防治的研究是 20世紀(jì)后2 0年國際衛(wèi)生保健研究的重點之。臨床上廣泛采用血糖參數(shù)來判定糖尿病，而血糖參數(shù)只代表抽血時的血糖水平，對確診有局限性。近年來的醫(yī)學(xué)研究證明：血液中的糖化血紅蛋白（HbA1c）濃度相對穩(wěn)定，其濃度值能準(zhǔn)確反映最近 2-3 個月期間的血糖水平，便于醫(yī)生對糖尿病進(jìn)行早期診斷；也可用于糖尿 病人的血糖監(jiān)控及慢性并發(fā)癥的判斷等，受到臨床的廣泛重視，目前我國各大、中型醫(yī)院正逐漸開展糖化血紅蛋白（HbA1c）占總血紅蛋白（Hb ）的百分含量的測定項目。有些發(fā)達(dá) 國家已將HbA1c 的測定列入中老年人的常規(guī)體檢項目。測定HbA1c 有多種方法，目前臨床上比較常用的

3、方法有兩種：乳膠凝集反應(yīng)法和離子交換高壓液相色譜法；分別用生化分析儀和糖化血紅蛋白自分析儀進(jìn)行測定。1、糖化血紅蛋白（HbA1c）的形成及特點血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白Hb 會在高糖的作用下發(fā)生緩慢的非酶促糖化反應(yīng)，血紅蛋白Hb 的B鏈 N 末端纈氨酸上的氨基與葡萄糖的醛基發(fā)生可逆的加成反應(yīng)”形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物-醛亞胺（前 GHbA1c）迅速重排成不可逆的酮胺，然后緩慢重構(gòu)形成HbA1c。糖化血紅蛋白 HbA1c 的特點：1. 1 糖化血紅蛋白 HbA1c 的百分比含量與即時所檢測到的血糖水平無關(guān)。1.2 由于紅細(xì)胞在外周血中的壽命是 90 120 天，所以糖化血紅蛋白 HbA1c 百分比反映

4、了測定前23個月的血糖平均水平。而GHbA1c 的合成始終在進(jìn)行，其糖化程度與血液中的葡萄糖濃度及持續(xù)時間呈正相關(guān)；病人用藥治療后，較血糖、尿糖含量下降晚3-4周， 糖化血紅蛋白 HbA1c 的百分比含量是對糖尿病長期控制有重要意義的一項指標(biāo)。2、 測定糖化血紅蛋白 HbA1c 的方法測定糖化血紅蛋白 HbA1c 的方法有（1）離子交換高壓液相色譜法HPLC ;包括：離子交換色譜及親和色譜；（2）微柱法；（3）免疫分析法，包括：放射免疫法、酶免疫法和乳膠 免疫凝集法。精品（3）電泳法(4)電噴離子質(zhì)譜等。2.1、 離子交換色譜分析法的原理：用高效微粒離子交換劑作固定相，以具有一定 pH 值的緩

5、 沖溶液作流動相，依據(jù)離子型化合物中各離子組分與離子交換劑上表面帶電荷基團(tuán)進(jìn)行可逆性離子交換能力的差別而實現(xiàn)分離。離子交換劑可以分成兩種：陽離子交換劑和陰離子交換劑。親和色譜法是利用生物高分子能與相應(yīng)的專一配基分子可逆結(jié)合的原理將配基通過共價鍵牢固地結(jié)合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。帶有雜質(zhì)的高分子分離目的物在一定條件下，能以某種次級鍵與已固相化的配基結(jié)合，而雜質(zhì)則不吸附，除去雜質(zhì)后變換條件，又可以使待分離的高分子物質(zhì)重新解離，獲得純化?；茄t蛋白被一種牢固的但可逆的五環(huán)絡(luò)合物所結(jié)合，通過它們的順-乙二醇基被硼酸固定住。首先洗脫的是非糖化血紅蛋白，隨后用含有山梨醇的緩沖液將糖化組分洗脫下來，

6、此緩沖液與結(jié)合在柱上的糖化血紅蛋白競爭硼酸結(jié)合位點。2.2、 免疫分析法使用單克隆或多克隆抗體直接測定血紅蛋白3鏈上糖基化的 N 末端的 4-8 個氨基酸，因此對 HbA精品1c 上的糖基特異性好。但是許多同源的糖化血紅蛋白變體也有相同的 N 末端結(jié)構(gòu)，從而對結(jié)果造成干擾。2.3、電泳法的分析原理是：非糖化血紅蛋白游離的氨基末端能與硫酸根反應(yīng)，改變分子的電泳遷移率。而化糖血紅蛋白不能與硫酸根反應(yīng)，電泳遷移率不變。血紅蛋白容易受到瓊脂板介質(zhì)中磺酸鹽基團(tuán)或以醋酸纖維膜作支持物的緩沖液中的硫酸右旋糖的硫酸鹽基團(tuán)作用， 經(jīng)過電泳分離，可以將糖化血紅蛋白從血紅蛋白中分離出來。2.4、電噴離子質(zhì)譜(ele

7、ctrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS 法研究證明，ESI-MS 法測出的是真正的 HbA1c，而目前臨床上使用的各種方法測出的實際上 是一系列混合物，包括糖化的 a 鏈、a 鏈和 b 鏈雙糖化及 b 鏈其他部位被糖化的產(chǎn)物。因此，用 ESI-MS 法測出的數(shù)值要低于目前臨床習(xí)用的各種方法。由于ESI-MS 法對儀器設(shè)備的要求較高，目前尚難廣泛用于臨床。3、臨床常用的測定糖化血紅蛋白HbA1c 的方法3.1、乳膠凝集反應(yīng)法乳膠凝集反應(yīng)法是利用抗原抗體直接測定總血紅蛋白 Hb 中的糖化血紅蛋白 HbA1c 的百分 含量。目前有國內(nèi)外幾家廠商可

8、以提供 HbA1c 測定的試劑盒。這種免疫反應(yīng)是由被測血樣 品中的總 Hb 和 HbA1c與試劑中的抗體結(jié)合而形成凝集，凝集量隨HbA1c 濃度的大小而變化。使用生化分析儀器來進(jìn)行比濁測定 HbA1c 的濃度，采用終點法，生化儀通過測定反應(yīng) 液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出 HbA1c 占 Hb 的百分含量，測定時， 儀器多采用 660nm 單色光做主波長，800nm 單色光做副波長，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出實測值。由于這種試驗其標(biāo)準(zhǔn)曲線是非線性的，所以在測定前，首先用隨試劑盒一起帶有的5 種不同濃度的定標(biāo)液，做出 5 點非線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線和數(shù)值存在生化儀的貯存器中，測定樣品時，實測出

9、的吸光度值 A 與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，由儀器 CPU 求出實測樣品中的 HbA1c 百分含量。乳 膠凝集反應(yīng)法測定 HbA1c 簡便、不用增加儀器，可直接用自動生化分析對樣品進(jìn)行快速測 定。該方法也可以用手工的方法，在酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，是目前使用較多的方法。但是許多同 源的糖化血紅蛋白變體也有相同的N 末端結(jié)構(gòu)，所以乳膠凝集反應(yīng)法其準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有欠缺。3.2、 離子交換高壓液相色譜法HPLC使用離子交換高壓液相色譜HPLC ( high pressure liquid chromatography)來測定 HbA1c 的百分含量目前被認(rèn)為是分析HbAlc 的金標(biāo)準(zhǔn)。采用 HPLC 方法工作的全自動

10、糖化血紅精品蛋白分析儀器，以其快速、簡便、精巧、準(zhǔn)確等特點，受到越來越多用戶的歡迎。321、高壓液相色譜分析的基本原理及發(fā)展史色譜分析是一類利用混合物的各組分在不同相上的分配差別，在兩相物質(zhì)相對運動過程中， 將混合物中的各種成份分離開的一種分析技術(shù)。液相色譜是以液體或固體為固定相，以液體為液動相的色譜法的總稱。色譜法又叫色層或?qū)游?，這一技術(shù)在生命科學(xué)研究中用于生物活 性物質(zhì)的分析；生物活性物質(zhì)是以混合物形式存在，人類血液中的蛋白質(zhì)有上千種，只有把混在一起的被測蛋白分離出來，才能準(zhǔn)確測定；在 HbAlc 的測定時，可以通過高精度 HPLC,將 HbAlc 從 Hb 中分離出來，才能得到準(zhǔn)確的數(shù)值

11、。在生命科學(xué)研究中，活性物質(zhì)的分離 主要應(yīng)用的是液相柱色譜。這種技術(shù)誕生于20 世紀(jì)初葉，俄國化學(xué)家茨維特把植物色素混合液置于裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管頂端，用石油醚洗脫后，在玻璃柱上出現(xiàn)了幾組顏色不同的色帶，這些色帶隨著不斷的洗脫，越分越開，先后從玻璃柱下端流出，茨維特把這樣一種用流體洗脫色素混合液，使之通過碳酸鈣做固定相從而實現(xiàn)分離的技術(shù)，起名叫“色譜 法”。這種方法被推廣用于分離許多混合物中的各種物質(zhì)，被分離物質(zhì)已和顏色無關(guān)了，但“色譜”分析的名稱仍沿用至今。 當(dāng)然更貼切的名稱應(yīng)該叫“層析法”。早期的“色譜柱”體積大，做固定相的物質(zhì)顆粒大，分離時需要大量的洗脫液。并且洗脫液靠重力流動， 分

12、離時間長，效率低。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，20 世紀(jì) 60 年代，人們研制出新型液相柱，同時采用高壓輸液泵自柱上端為洗脫液加壓，大大加速了洗脫液的流速，開發(fā)出相應(yīng)的高靈敏度的檢測器，新的分析儀器一高壓液相色譜儀在70 年代誕生，很快就占領(lǐng)了分析化學(xué)的舞臺。特別是在生命科學(xué)的研究中，HPLC 技術(shù)由于對被測物活性影響小，幾乎可以測定生物醫(yī)學(xué)中所有的非發(fā)揮性物質(zhì)， 如近年來利用離子交換 HPLC 法測定血液中的 HbAlc 的百分含量， 被認(rèn)為是糖尿病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。322、 離子交換 HPLC 法測定 HbAlc離子交換 HPLC 法，是利用能交換離子的材料為固定相來分離離子型化合物的方法。HbAlc

13、的百分比測定使用陽離子交換柱；當(dāng)一定量的全血樣品被取樣針吸入到進(jìn)樣裝置內(nèi)，在稀釋部分被溶血，釋放出紅細(xì)胞中的血紅蛋白Hb，并由稀釋液稀釋， 稀釋好的已經(jīng)溶血的樣品，由高壓泵注入離子交換柱。柱內(nèi)的固定相是最新開發(fā)的非多孔性，不溶和可滲透的交聯(lián)高聚物，上面分布固定的帶電荷基團(tuán)和能游動的配衡離子；樣品通過過濾器從交換柱頂端加入后，由三種不同濃度的鹽洗脫緩沖液（流動相）洗脫，使樣品向下移動。 此時溶液中所含血紅蛋白（Hb）的各種組份即與固定相上能移動的離子進(jìn)行交換，樣品中的血紅蛋白多種組份在 固定相上連續(xù)進(jìn)行可逆的交換吸著和解吸作用，而 3 種不同離子濃度的鹽液， 形成線性梯度洗脫，洗脫液 No1 叫

14、起始緩沖液，含低離子濃度的鹽，洗脫液No2、No3 緩沖液，其離子濃度依次增高很多，這種流動相離子濃度的改變對分離效果的影響非常明顯，前面洗脫出來的組分分離效果好， 色譜峰很窄，后面組分也能在很短時間內(nèi)洗脫出來，大大縮短了分離時間；所以全自動血紅蛋白分析儀，在1 分多鐘內(nèi)、Hb 中的多種成份被分離成 6 個部分，其1c、HbF、HbA1 被有效、精確的分離；由交換柱流出的Hb 成分到達(dá)儀器的檢測器，檢測精品中的 HbA器內(nèi)裝有發(fā)射單色光的發(fā)光二極管，通過雙波長可見光比色法測定HbAlc、HbF、HbA1 三個參數(shù)。儀器的檢測器檢測出分離后HbAlc、HbF、HbA1 組分的吸光度值，與 HbA

15、lc 標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較，分析計算出結(jié)果，最后以百分率表示的Hb 組分結(jié)果與色譜圖一起打印出來。離子交換柱 HPLC 法對全血直接測定 HbAlc，其批內(nèi)和批間變異系數(shù) CV 均可以小于 1% (CV10 8-10 8 7- 8 9%時，說明患者存在著持續(xù)性高血糖，可以出現(xiàn)糖尿病腎病、動脈硬化、白內(nèi)障等并發(fā)癥。臨床經(jīng)常以糖化血紅蛋白作為監(jiān)測指標(biāo)來了解患者近階段的血糖情況，以及估價糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展情況。5.5、對預(yù)防糖尿病孕婦的巨大胎兒、畸形胎、死胎，以及急、慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的監(jiān)督具有重要意義。5.6、對于病因尚未明確的昏迷或正在輸注葡萄糖(測血糖當(dāng)然增高)搶救者，急查糖化血紅蛋白

16、具有鑒別診斷的價值；如果HbA1c %升高，則是尿糖性昏迷。1c、HbF、HbA1 被有效、精確的分離；由交換柱流出的Hb 成分到達(dá)儀器的檢測器，檢測精品5.7、 對于糖化血紅蛋白特別增高的糖尿病患者，應(yīng)警惕如酮癥酸中毒等急性合并癥的發(fā)生。精品參考文獻(xiàn):1、 Krishnamuriti U,Stekfes MW,Glycohemoglbin:a primary predictor of the development or reversal ofcomplications of diabetes mellitus.Clin Chem 2001;47:2、 Tominaga M,Kobayashi l,Kuwa K,et,al,Report of the Committee on Standardization of LabortoryTesti ng Related to Diabetes Mellitus,Nati onal Survery on Glycohemoglob in,J Japa n DiabetesSociety 2001;44.3、 Kenn eth E MD Laboratory Diag no sis and Mo nitori ng of Diabetes MellitusJ,Am J ClinPathol,1999,112.4 Kilpatrick